脂氧素A4抗肝癌作用及機制研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：體外實驗研究LXA4對人肝癌細胞epithelial-mesenchymal transition、凋亡、增殖、遷移、血管新生的影響及其機制；體內(nèi)實驗通過構(gòu)建H22荷瘤小鼠模型，研究LXA4類似物BML-111對原發(fā)瘤增殖，血管新生，炎細胞浸潤，侵襲及轉(zhuǎn)移的影響及其機制。
　　 方法：采用脂多糖和激活巨噬細胞上清液分別體外模擬炎癥微環(huán)境模型，分別通過HE 染色，免疫熒光，western blotti

2、ng 及RT-PCR檢測LXA4對HepG2細胞EMT轉(zhuǎn)變的影響；通過Hoechst染色、免疫熒光和流式細胞檢測LXA4對HepG2細胞凋亡的影響；MTT、RT-PCR和western blotting觀察LXA4對HepG2細胞增殖的影響及其機制；傷口愈合實驗觀察LXA4 對HepG2細胞遷移的影響；ELISA法檢測LXA4對HepG2細胞上清液中內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）的影響；體內(nèi)實驗觀察BML-111對H22荷瘤小鼠原發(fā)瘤細胞

3、侵襲，血管新生，凋亡，增殖，炎細胞浸潤及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及其機制。
　　 結(jié)果：
　　 1．LXA4能有效抑制LPS誘導HepG2細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變。HE形態(tài)觀察，LPS刺激后，細胞排列松散，加入LXA4干預后，細胞恢復上皮細胞的緊密連接。
　　 2．LXA4促進HepG2的細胞凋亡。LPS刺激后，HepG2細胞凋亡減少，Bcl-2表達增強，而加入LXA4干預后，HepG2細胞凋亡明顯增多，同時Bcl-2表達減弱。

4、流式細胞檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，50nM的LXA4能有效促進HepG2細胞凋亡。
　　 3．LXA4能有效抑制LPS誘導的HepG2細胞的增殖。MTT 結(jié)果顯示100，200，400nM的LXA4均能有效抑制LPS誘導的HepG2細胞的增殖。我們同時檢測了增殖指標核仁素（C23）和調(diào)控蛋白核干素（nucleostemin，NS）的表達變化。免疫熒光、RT-PCR和western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)LXA4能有效抑制C23和NS的

5、表達，并且呈濃度依賴。同時我們還發(fā)現(xiàn)，LXA4能夠通過抑制NF-κBp65來調(diào)控增殖。SiRNA沉默LX受體（FPRL1）后，LXA4抗增殖作用消失。
　　 4．臨床標本觀察發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，肝癌組織內(nèi)有更多的白細胞和巨噬細胞浸潤，說明巨噬細胞參與了肝癌的演進過程。我們還發(fā)現(xiàn)肝癌組織內(nèi)表達更多的VEGF。
　　 5．LXA4 能有效抑制ACM誘導的HepG2細胞的增殖。MTT結(jié)果顯示，ACM能有效促進HepG2細

6、胞增殖，而LXA4能抑制其誘導的增殖。RT-PCR，westernblotting和免疫熒光結(jié)果顯示LXA4能抑制ACM誘導的C23和NS的表達上調(diào)，并能抑制NF-κBp65的轉(zhuǎn)位，抑制IκBα的降解。JNK特異性阻斷劑SP600125能減弱LXA4的作用。
　　 6．LXA4能有效抑制LPS或ACM誘導的HepG2細胞的遷移增加及VEGF 增高。
　　 LPS或者ACM能加快HepG2細胞的遷移，而LXA4能抑制遷移。

7、LPS顯著提高了VEGF表達水平，VEGF表達水平從1023.4pg/ml上升至1285.0 pg/ml（P<0.05），200nM和400nM LXA4能分別降低其表達水平至748.5和547.5pg/ml（P<0.05）。U937/ACM使VEGF水平從對照組的578.7pg/ml上升至745.6pg/ml（P<0.05），而加入LXA4后，VEGF降低至547.5pg/ml，與U937/ACM 相比明顯降低（P<0.05）。

8、>　　 7．LXA4 能抑制ACM 誘導的HepG2細胞發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)變。HE 染色發(fā)現(xiàn)，四種不同來源（包括U937，THP-1，RAW264.7和PBMCs）的ACM 均能促進HepG2 發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)變，而LXA4 能有效抑制其誘導的EMT 轉(zhuǎn)變。
　　 8．體內(nèi)實驗中BML-111對H22荷瘤小鼠原發(fā)瘤及肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。PBS組，腫瘤組織與其周邊組織邊界不清楚，包膜不完整，腫瘤組織侵犯脂肪組織；而BML-111組，腫瘤

9、組織與其周邊組織邊界非常清楚，包膜完整。PBS組，腫瘤內(nèi)血管豐富，不見壞死；而BML-111組，腫瘤內(nèi)血管稀少，伴有壞死。
　　 TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BML-111處理后，腫瘤細胞凋亡明顯增加。PBS組，NS的表達主要位于腫瘤內(nèi)部；而BML-111組，腫瘤組織沒有表達，NS表達在腫瘤組織和周圍正常組織交界的部位。另外，BML-111組表達VEGF水平較低。我們以CD68和CD45分別作為巨噬細胞和白細胞的標記物，與PBS組相

10、比，BML-111組兩種細胞的浸潤明顯減少。在肺組織內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)PBS組肺內(nèi)出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移瘤，轉(zhuǎn)移瘤在肺內(nèi)呈結(jié)節(jié)樣分布。高倍鏡下觀察，腫瘤異型性明顯，且與原發(fā)瘤具有共同特征。而BML-111組，肺野清晰，無轉(zhuǎn)移瘤。
　　 9．LXA4抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。體外實驗中，免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LXA4能有效抑制LPS誘導的OPN表達上調(diào)，RT-PCR結(jié)果顯示LXA4的這種作用能被ERK特異性阻斷劑，PD98059阻斷。LXA4同時也下調(diào)MM

11、P9的表達。Westernblotting結(jié)果顯示，50，100，200和400nM的LXA4均能增加E-cadherin的表達，下調(diào)Vimentin的表達，并下調(diào)P53的表達。但是50nM LXA4抑制P53的作用最強，而200nM LXA4對E-cadherin和Vimentin的調(diào)節(jié)作用最強。體內(nèi)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，BML-111能下調(diào)原發(fā)瘤內(nèi)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和P53的表達，而上調(diào)E-cadherin的表達

12、。
　　 結(jié)論：
　　 1．LXA4能有效抑制LPS誘導HepG2細胞發(fā)生的EMT轉(zhuǎn)變，Boc-2能夠減弱這種效應；
　　 2．LXA4促進HepG2細胞發(fā)生凋亡；
　　 3．LXA44 通過NF-κB和JNK通路抑制ACM誘導的HepG2細胞增殖；
　　 5．LXA4有效抑制ACM誘導HepG2細胞發(fā)生的EMT轉(zhuǎn)變；
　　 6．LXA4能抑制LPS或ACM誘導的HepG2細胞遷移加快和V

13、EGF表達增多；
　　 7．體內(nèi)實驗中，BML-111抑制H22荷瘤小鼠原發(fā)瘤中肝癌細胞的增殖，血管新生，侵襲和炎細胞浸潤，并促進肝癌細胞凋亡；
　　 8．LXA4和BML-111可能是通過ERK通路下調(diào)OPN，P53和MMP9，上調(diào)E-cadherin發(fā)揮其抗腫瘤轉(zhuǎn)移效應。
　　 第二部分
　　 目的：研究LXA4在調(diào)控LPS誘導的HepG2細胞Nrf2和下游二期酶中的作用及其機制，同時也研究LXA4是

14、否能提高HepG2細胞對化療藥物的敏感性。
　　 方法：臨床標本檢測Nrf2及其二期解毒酶和抗氧化酶在肝癌組織及癌旁組織中的表達情況。體內(nèi)實驗觀察BML-111是否能抑制H22荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)Nrf2的表達。體外實驗觀察LXA4對Nrf2的轉(zhuǎn)位，二期酶的表達，ROS的產(chǎn)生，GPx和MnSOD的活性的影響。RNA干擾實驗觀察LXA4對Nrf2的調(diào)控是否為受體依賴。聯(lián)合運用長春新堿（Vincristine，VCR）和LXA4用來觀

15、察LXA4是否能提高對化療的敏感性。
　　 結(jié)果：
　　 1.與癌旁組織相比，肝癌組織內(nèi)Nrf2及二期解毒酶和抗氧化酶表達明顯增高。
　　 2．BML-111抑制了H22荷瘤小鼠原發(fā)瘤組織中Nrf2的表達。BML-111處理小鼠后，Nrf2的表達（陽性表達率為69.07％±0.07）明顯低于PBS組（陽性表達率為8.44％±0.03）。
　　 3．LXA4通過其受體FPRL1及抑制ERK下調(diào)LPS誘導的H

16、epG2細胞Nrf2及其二期酶表達增高。
　　 4．LXA4抑制LPS誘導HepG2細胞Nrf2核轉(zhuǎn)位。
　　 5．LXA4抑制SOD和GPx的活性。LXA4能夠明顯下調(diào)SOD和GPx的活性，而PD98059能減弱這種效應。
　　 6．LXA4增加了ROS的產(chǎn)生。LXA4能夠增加HepG2細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，而LPS能夠下調(diào)ROS，并且PD98059能夠減弱LXA4的效應。
　　 7．LXA4增加HepG