脂氧素A4對(duì)大鼠皮瓣和肌肉組織缺血再灌注損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:脂氧素A4對(duì)大鼠帶蒂皮瓣缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究
　　目的:研究脂氧素A4對(duì)大鼠帶蒂皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　方法:建立大鼠腹壁上動(dòng)脈帶蒂皮瓣缺血再灌注損傷模型，靜脈注射脂氧素A4，在術(shù)后72小時(shí)，通過(guò)大體形態(tài)計(jì)算皮瓣成活面積，激光多普勒血流成像檢測(cè)皮瓣血流灌注。HE染色觀察皮瓣組織學(xué)改變，ELISA檢測(cè)皮瓣中IL-1β，IL-6，TNF-α炎癥因子含量。同時(shí)檢測(cè)皮瓣中MDA含量及SOD活性。TUNEL

2、染色觀察皮瓣細(xì)胞凋亡比例，通過(guò)western blotting檢測(cè)抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1及凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl2含量變化。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和western blotting檢測(cè)LC3蛋白含量。
　　結(jié)果:LA4顯著增加缺血再灌注損傷皮瓣成活面積，增加皮瓣血流灌注量。LA4減輕缺血再灌注導(dǎo)致的組織損傷，降低缺血再灌注損傷皮瓣中MDA含量，升高SOD活性，同時(shí)抑制炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α釋放。L

3、A4抑制皮瓣缺血再灌注損傷所致細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl2表達(dá)。LA4促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位并促進(jìn)HO-1表達(dá)。LA4還促進(jìn)缺血再灌注損傷皮瓣組織中LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)變，提高細(xì)胞自噬水平。
　　結(jié)論:LA4通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡，調(diào)節(jié)自噬水平保護(hù)皮瓣組織缺血再灌注損傷。
　　第二部分:脂氧素A4對(duì)大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究
　　目的:研究LA4對(duì)大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

4、及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:建立大鼠下肢肌肉缺血再灌注損傷模型，通過(guò)靜脈注射不同劑量的LA4。再灌注后3小時(shí)，觀察下肢肌肉組織水腫，免疫熒光染色法標(biāo)記中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，HE染色觀察肌肉組織損傷狀態(tài)，ELISA檢測(cè)肌肉組織中炎癥因子TNF-α、IL-Iβ及IL-6含量。同時(shí)檢測(cè)抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶SOD、CAT、GSH-Px活性，TUNEL染色觀察肌細(xì)胞凋亡比例。Western blotting檢測(cè)抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1和凋亡相

5、關(guān)蛋白Bax、Bcl2表達(dá)變化。透射電鏡觀察肌肉組織自噬體數(shù)量。免疫熒光染色和western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1含量變化。
　　結(jié)果:大鼠肌肉缺血再灌注損傷導(dǎo)致肌肉水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肌肉組織學(xué)損傷，炎癥因子水平增高，抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性下降，細(xì)胞凋亡比例增高。LA4能減輕肌肉組織水腫，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。LA4還能減輕肌肉組織學(xué)損傷程度。LA4降低缺血再灌注組織中炎癥因子含量，增加抗氧化應(yīng)激

6、相關(guān)酶的活性。LA4還增加抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)并降低促凋亡蛋白Bax表達(dá)。LA4對(duì)肌肉缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與其激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)，當(dāng)加入HO-1抑制劑(ZnPPⅨ)時(shí)，LA4對(duì)肌肉組織缺血再灌注損傷的保護(hù)作用明顯被抑制。LA4還促進(jìn)缺血再灌注損傷肌肉組織中自噬體的形成，促進(jìn)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)變，增加Beclin1表達(dá)。
　　結(jié)論:LA4通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)自噬保護(hù)肌肉組織缺血再灌注損傷

7、，其保護(hù)作用與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)。
　　第三部分:脂氧素A4對(duì)骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究
　　目的:通過(guò)體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀察LA4對(duì)骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　方法:使用不同濃度的H2O2（0，25，50，100，200，400μmol/L）刺激大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞（L6細(xì)胞），模擬骨骼肌缺血再灌注損傷，確定H2O2損傷骨骼肌細(xì)胞的最佳時(shí)間和濃度。在H2O2損傷

8、細(xì)胞前，不同濃度(0，0.1，1，10，100 nmol/L) LA4預(yù)處理細(xì)胞12小時(shí)，確定LA4對(duì)L6細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的最佳保護(hù)濃度。MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞活性變化，檢測(cè)ROS含量判斷細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度。光鏡下形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所致細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并檢測(cè)培養(yǎng)液中CK、LDH活性判斷細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量判斷細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。TUNEL染色觀察骨骼肌細(xì)胞凋亡比例，Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白

9、Bcl2，Bax含量變化。
　　結(jié)果:H2O2氧化應(yīng)激損傷骨骼肌細(xì)胞的最佳濃度為200μmol/L，最佳作用時(shí)間為4小時(shí)，可造成細(xì)胞活性下降至對(duì)照組55％。LA4（10 nmol/L）顯著增加H2O2損傷的骨骼肌細(xì)胞活力。LA4還能夠抑制H2O2損傷所致ROS的生成，抑制CK、LDH向培養(yǎng)液中釋放，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗。LA4促進(jìn)Bcl2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，降低H2O2損傷所致細(xì)胞凋亡比例。
　　結(jié)論:LA4在體外培養(yǎng)的

10、骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中，顯著增加細(xì)胞活力、抑制ROS生成、增加細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，抑制氧化應(yīng)激損傷所致細(xì)胞凋亡，對(duì)骨骼肌氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用。
　　第四部分:脂氧素A4對(duì)骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)機(jī)制研究
　　目的:在骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中，研究LA4保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:在體外骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中，通過(guò)免疫熒光染色，westernblotting檢測(cè)LA4對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路及自噬

11、水平的影響。同時(shí)通過(guò)westernblotting檢測(cè)LA4對(duì)ERK、P38、JNK、PI3K/AKT信號(hào)通路的作用，并研究ERK、P38、JNK、PI3K/AKT信號(hào)通路與Nrf2/HO-1信號(hào)通路、自噬的關(guān)系。
　　結(jié)果:LA4在體外骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時(shí)增加HO-1蛋白的表達(dá)。LA4提高骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí)自噬水平。LA4通過(guò)激活ERK通路而激活Nrf2/