告達(dá)庭的抗肝癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，由于起病隱匿、早診困難及進(jìn)展迅速，大于80％的患者就診時(shí)已屆中晚期，治療棘手，預(yù)后很差。原發(fā)性肝癌90％為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。迄今為止，肝癌的藥物治療還存在諸多未知領(lǐng)域和困難，不懈地探求有效且耐受良好的肝癌治療新藥仍是一項(xiàng)持續(xù)性工作。發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，探尋高效的抗肝癌藥物并闡明其抗腫瘤的分子機(jī)理，對(duì)于提高肝癌療效有著積極的意義。告達(dá)庭(caudatin

2、)是從傳統(tǒng)補(bǔ)益類(lèi)中藥白首烏中提取的一種C21甾體苷元，其具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性的研究已有部分報(bào)道，體外研究表明告達(dá)庭對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，但關(guān)于其抗肝癌作用的詳細(xì)機(jī)制還需深入研究。本論文通過(guò)研究告達(dá)庭在體內(nèi)外對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響，進(jìn)一步觀察了其對(duì)肝癌的作用并探討了其作用機(jī)制。
　　第一部分理論研究
　　目的:探討肝癌的病因病機(jī)和防治方藥特點(diǎn)及規(guī)律，加強(qiáng)中醫(yī)對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)，以利于指導(dǎo)

3、臨床治療。方法:研究、整理古代經(jīng)典醫(yī)籍中肝癌相關(guān)病證的論述及近年來(lái)中醫(yī)藥防治肝癌的文獻(xiàn)和研究現(xiàn)狀。結(jié)果:古代醫(yī)家對(duì)肝癌病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)主要包括外邪侵襲、飲食不節(jié)、起居不慎、正氣不足、臟腑虧虛、情志所傷等幾個(gè)方面;現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為肝癌的基本病理特征可概括為虛、毒、瘀、痰、濕、熱;在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，癌毒、濕熱、痰濁、瘀血、水飲往往膠結(jié)錯(cuò)雜，互相影響。古今用藥各有側(cè)重，治療應(yīng)注重扶正祛邪，標(biāo)本兼顧。結(jié)論:中醫(yī)藥防治肝癌的思路在于治本責(zé)脾腎，扶

4、正以祛邪;辨病與辨證結(jié)合，分期施治，突出扶正、祛邪之側(cè)重，有的放矢;病機(jī)復(fù)雜多重，治宜復(fù)法合方。
　　第二部分告達(dá)庭抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的體外研究
　　目的:研究告達(dá)庭在體外對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。方法:MTT比色法檢測(cè)告達(dá)庭對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞抑制活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率;Western blot檢測(cè)β-catenin、GSK3β、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá);qPCR檢測(cè)Cyc

5、lin D1、COX-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá);Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移率。結(jié)果:體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中告達(dá)庭對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的抑制其生長(zhǎng)的作用，24 h時(shí)IC50值為89.49μM，48 h時(shí)IC50值為54.43μM，72 h組的IC50值為118.07μM，生長(zhǎng)抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系;流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示告達(dá)庭可引起腫瘤細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期進(jìn)程的G1期，與空白組對(duì)照，低、中、高劑量組細(xì)胞凋

6、亡率分別提高到10.67％、17.65％、22.52％;β-catenin、GSK3β、MMP-2、MMP-9蛋白和Cyclin D1、COX-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)顯著下降;與空白組對(duì)照低、中、高劑量組腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率分別下降至9.85％、7.71％、7.29％。結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證明告達(dá)庭對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，可明顯降低肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，其作用可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路

7、有關(guān)。
　　第三部分告達(dá)庭抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤的體內(nèi)研究
　　目的:人肝癌細(xì)胞皮下移植動(dòng)物模型觀察告達(dá)庭對(duì)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。方法:建立裸小鼠皮下異種移植瘤模型，低、高劑量組分別灌胃50、100 mg/kg告達(dá)庭，15天后處死，稱(chēng)體重、瘤重，計(jì)算抑制率;免疫組化分析Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白MMP-2、VEGF、COX-2、β-catenin的變化情況。結(jié)果:告達(dá)庭低、高劑量組腫瘤抑制

8、率分別為74.72％(P＜0.01)，60.84％(P＜0.01);與空白組比較低、高劑量組VEGF表達(dá)下調(diào)至5.07％、7.10％; MMP-9表達(dá)下調(diào)至4.41％、5.38％; COX-2表達(dá)下調(diào)至3.01％、6.56％;β-catenin表達(dá)下調(diào)至9.02％、11.11％。結(jié)論:告達(dá)庭可顯著抑制人肝癌SMMC-7721荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，降低裸鼠移植瘤內(nèi)β-catenin、MMP-2、VEGF、COX-2的表達(dá)。
　　通過(guò)本