枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10抗肝癌作用及免疫機(jī)制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性疾病，以其強(qiáng)烈的侵襲性和轉(zhuǎn)移性、極短的存活率使之迅速竄升我國惡性腫瘤死亡率的第二位。由于肝癌發(fā)病的隱匿性，絕大部分患者在就診時(shí)已處于臨床晚期，無法進(jìn)行手術(shù)根除治療，且由于荷瘤機(jī)體內(nèi)T輔助淋巴細(xì)胞(Helper T Cells，Th)分化失衡、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)數(shù)量減少及功能缺陷，機(jī)體抗腫瘤

2、免疫無能或低下、化療效果及預(yù)后均差。文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體的免疫能力對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用，免疫療法已成為當(dāng)今抗癌治療的重中之重，如何提高荷瘤機(jī)體抗腫瘤免疫力成為目前肝癌治療的核心問題，基于中藥多糖在預(yù)防肝癌發(fā)生及減少復(fù)發(fā)，拮抗放、化療的毒副作用，增強(qiáng)免疫力延長生存期等方面的優(yōu)勢，臨床上聯(lián)合中藥多糖治療肝癌的應(yīng)用也越來越廣泛。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)是中藥枸杞子發(fā)揮抗腫

3、瘤作用的關(guān)鍵成分，大量藥理實(shí)驗(yàn)研究表明LBP對荷瘤機(jī)體產(chǎn)生顯著的免疫調(diào)節(jié)作用（如調(diào)節(jié)荷瘤機(jī)體多種免疫效應(yīng)細(xì)胞:T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞活性以及誘生多種抗癌細(xì)胞因子的功能），從而抑制腫瘤生長，但其作用于腫瘤的具體分子及免疫學(xué)機(jī)制尚未清楚。文獻(xiàn)報(bào)道CXC趨化因子配體10(C chemokine ligand10 XCL10)可以趨化T細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞至腫瘤發(fā)生部位殺死腫瘤細(xì)胞，并且CXCL10的表達(dá)與肝

4、炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病關(guān)系尤為密切，枸杞多糖聯(lián)合細(xì)胞因子CXCL10治療肝癌是一次嶄新的嘗試，本實(shí)驗(yàn)組在前期課題組的研究基礎(chǔ)上，首先通過體外實(shí)驗(yàn)，，明確LBP在細(xì)胞水平上對人肝癌HepG2細(xì)胞生長具有抑制作用，其次通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)物水平上探討LBP單用或者聯(lián)合CXCL10抗實(shí)驗(yàn)性肝癌作用及其具體的免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法：⑴確定LBP對HepG2的抑制效果:將HepG2細(xì)胞混懸液以3500/孔種于96孔板，以200mg/L，4

5、00mg/L800mg/L，1000mg/L四個(gè)濃度加藥作用于HepG2，另設(shè)不加藥組對照。以MTT法檢測藥物作用癌細(xì)胞的相對抑制率。⑵LBP聯(lián)合氟尿嘧啶的增敏作用:選用LBP兩個(gè)劑量(200mg/L，400mg/L)聯(lián)合5FU(1 umol/L)，另設(shè)單藥及不加藥對照組，以MTT法檢測各組藥物作用癌細(xì)胞抑制率，以金氏Q值法評定兩藥協(xié)同或相加效果。⑶建立實(shí)驗(yàn)性肝癌小鼠(H22皮下瘤)模型，隨機(jī)分為腫瘤模型組、LBP(50mg/kg)灌胃

6、組、LBP+CXCL10(50 mg/kg灌胃+右脅皮下注射15ug/kg)組、CXCL10(右脅皮下注射15ug/kg)組、環(huán)磷酰胺(20mg/kg)或氟尿嘧啶(5FU)(12mg/kg)腹腔注射組，每組12只。每天給藥一次，連續(xù)兩周后眼球取血，分離小鼠腫瘤、脾臟、胸腺后稱重，計(jì)算腫瘤抑制率、脾臟及胸腺指數(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th1/TH2分化情況，ELISA技術(shù)檢測各組小鼠外周血γ-干擾素(IFN-γ))，白介素-4（IL-4

7、）蛋白表達(dá)情況。熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血白介素-12(IL-12)及腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA表達(dá)，制作腫瘤組織病理切片，常規(guī)HE染色觀察各組腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞密度及淋巴細(xì)胞浸潤情況，免疫組化方法檢測S-100蛋白在腫瘤間質(zhì)浸潤DC的表達(dá)。
　　結(jié)果：①枸杞多糖對人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用及聯(lián)合氟尿嘧啶增效作用與空白對照組相比較，枸杞多糖在200mg/L，400mg/L800mg/L，1000mg/L的抑制率

8、分別為9.23％，22.80％，36.84％，76.25％，枸杞多糖(200mg/L、400mg/L)聯(lián)合5FU(1umol/L)后的Q值分別為1.12，1.62，為相加和協(xié)同作用。②枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠的抑瘤及對免疫器官的影響枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對肝癌小鼠的腫瘤生長均起到了明顯的抑制作用，與模型組相比，各用藥組腫瘤體質(zhì)量均降低，尤其以LBP、LBP+CXCL10、陽性用藥組（5FU組）效果顯著，各用

9、藥組抑制率分別達(dá)到了55.90％，52.82％，65.58％，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; LBP、LBP+CXCL10明顯提高了脾指數(shù)，LBP、LBP+CXCL10、CXCL10組胸腺指數(shù)均有上升趨勢，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)差異。③枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠外周血T輔助細(xì)胞分化結(jié)果枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10組對H22使荷瘤小鼠外周血Th1細(xì)胞增多（由模型組10.61±4.72分別提高至28.38±21.98、24.26±1

10、3.86）而Th2細(xì)胞減少（由模型組21.48±23.23分別減低至7.71±5.24、5.46±2.90）的明顯趨勢，Thl/Th2比率也有所提高，由模型組的0.87±0.42分別上升到6.05±7.83，6.12±3.89。④枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠外周血γINF、IL4蛋白表達(dá)的影響與腫瘤模型組相比，枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10能使H22肝癌小鼠外周血INF-γ分別提高至134.26±19.62、129.4

11、4±24.47ng/mL，使外周血IL4分別降低至62.77±8.79、58.10±8.54ng/mL，INF-γ/IL4比值分別提高至2.14±0.10、2.22±0.13，且P均＜0.05。⑤枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠外周血IL12、TNF-α mRNA表達(dá)與模型組相比，枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10使荷瘤小鼠外周血IL-12mRNA表達(dá)分別上調(diào)了2.94、3.39倍(P＜0.05)，而TNF-α分別上調(diào)1.55

12、、4.74倍(P＜0.05)。⑥枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠腫瘤浸潤DC的S-100蛋白表達(dá)影響免疫組織化學(xué)方法檢測S-100蛋白腫瘤浸潤DC的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10用藥組S-100DC數(shù)量明顯增多，多表現(xiàn)為高度浸潤，均具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)
　　結(jié)論：⑴LBP及LBP+CXCL10可以通過提升荷瘤小鼠的脾臟、胸腺等免疫器官指數(shù)，提高機(jī)體整體的免疫功能；⑵LBP及LBP+