貝伐單抗聯(lián)合吉西他濱的抗肝癌的協(xié)同作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的： 原發(fā)性肝癌(hepaticcellcarcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是世界上常見的惡性腫瘤之一，肝癌死亡率占我國惡性腫瘤死亡率的第二位。包括肝癌在內(nèi)的多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，血管生成可為腫瘤細(xì)胞的增殖提供營養(yǎng)和代謝的通路，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，加快病情的惡化，故腫瘤血管生成現(xiàn)已成為熱門的研究領(lǐng)域。 貝伐單抗(Bevacizumab，Avastin，rhuMAb-VEGF)是人

2、工合成的一種針對血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的重組人源化IgG1型單克隆抗體。Bevacizumab特異性結(jié)合于VEGF后能阻礙后者與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體Flt-1及KDR結(jié)合，阻斷VEGF介導(dǎo)的下游信號通路，使VEGF不能發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及腫瘤內(nèi)血管新生的作用，從而阻斷對腫瘤生長至關(guān)重要的血液、氧氣和其他生長必需的營養(yǎng)供應(yīng)，使腫瘤無法在體內(nèi)生長和散播轉(zhuǎn)移，令化療能夠

3、發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，進(jìn)而延緩腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。 Bevacizumab與放、化療聯(lián)合具有協(xié)同作用：①可使腫瘤區(qū)血管生成正?；M織間高壓減輕，利于化療藥物向腫瘤區(qū)輸送。②放、化療所致局部腫瘤區(qū)缺氧可促VEGF表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞抵抗放、化療的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制；而聯(lián)用Bevacizumab將預(yù)防此繼發(fā)保護(hù)效應(yīng)，使治療反應(yīng)增敏。 臨床觀察到聯(lián)合VEGF單抗和化療所建立的生物化療模式取得的有效率不僅遠(yuǎn)高于單用化療或VEGF單抗，而

4、且超過二者代數(shù)和，特別是對一部份復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病人，已經(jīng)無效的化療藥物在使用Bevacizumab等分子靶向藥物后重新恢復(fù)敏感性。似乎Bevacizumab的抗腫瘤作用除了抑制腫瘤血管形成以外，還包括增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。國內(nèi)外目前均無對這種現(xiàn)象的合理解釋。 本課題研究的主要目的是探討靶向藥物與化療藥物單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對肝癌的抑制作用，靶向藥物與化療的協(xié)同作用，為肝癌的綜合治療、提高療效提供實(shí)驗(yàn)資料。 第一章：貝伐單

5、抗對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用 方法： 1、采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法分析肝癌細(xì)胞株中VEGF、Flt-1、KDR基因和蛋白水平的表達(dá)：選用肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞并選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304作為VEGF受體表達(dá)的陽性對照，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)從中篩選VEGFmRNA表達(dá)量高，F(xiàn)lt-1、KDR陽性表達(dá)且mRNA表達(dá)量高的肝癌細(xì)胞株，用于本課題的研究； 2、MTT法檢測Be

6、vacizumab對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用：無血清條件下，0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h，采用單因素方差分析(LSD法)比較不同濃度間及與對照組的增殖情況； 3、AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡：無血清條件下，10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h后，經(jīng)ArmexmV-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況

7、。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析比較Bevacizumab組和對照組； 4、RT-PCR分析肝癌細(xì)胞株VEGF、Flt-1、KDRmRNA表達(dá)量的變化：無血清條件下，10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h后，行RT-PCR檢測。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。 結(jié)論： 1、人肝癌細(xì)胞株中存在VEGF及其受體的共同表達(dá)； 2、Bevacizumab作用于肝癌細(xì)胞株HepG2后，其增殖受抑；細(xì)胞凋亡率

8、增高； 3、Bevacizumab對HepG2的增殖抑制作用可能是通過KDR介導(dǎo)的，同時(shí)隨著腫瘤細(xì)胞的增殖抑制，其VEGF表達(dá)減少； 4、Bevacizumab可能通過阻滯VEGF的自分泌作用而發(fā)揮對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。 第二章：貝伐單抗聯(lián)合吉西他濱對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用 方法： 1、MTT法檢測Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用：實(shí)驗(yàn)分組為：10μg/mlBevac

9、izumab組，0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml吉西他濱組和Bevacizumab+不同濃度吉西他濱聯(lián)合組，對照組加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)72h后行MTT檢測。采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析； 2、WesternBlot檢測Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對HepG2中ERK1/2、Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)的影響：分別將Bevacizumab、吉西他濱、Bevacizumab聯(lián)

10、合吉西他濱及安慰劑作用于HepG2細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白后，行WesternBlot檢測。 結(jié)論： 1、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱可增強(qiáng)吉西他濱單藥對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用； 2、應(yīng)用了化療藥物后，ERK基因的表達(dá)被明顯抑制，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。無論化療藥物還是分子靶向藥物，均可以下調(diào)Bcl-2及Bcl-xl的表達(dá)，而當(dāng)兩藥聯(lián)合時(shí)，Bcl-2及Bcl-xl的表達(dá)下降更為明顯。提示兩者協(xié)同顯著增強(qiáng)對靶向藥物及化療

11、敏感性的機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡及調(diào)控Bcl-2及Bcl-xl的表達(dá)有關(guān)。 第三章：貝伐單抗聯(lián)合吉西他濱對肝癌裸鼠皮下移植瘤治療作用的研究 方法： 1、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對肝癌移植瘤體積和MVD的影響：建立人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤模型，每隔3天觀察一次，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的大小。實(shí)驗(yàn)分A組：空白對照組，予以無菌生理鹽水，0.2ml/只；B組：Bevacizumab組，5mg/kg；C組：吉西他

12、濱組，100mg/kg；D組：Bevacizumab5mg/kg+吉西他濱100mg/kg聯(lián)合組。各組給藥均為2次/周，共4周，腹腔注射。自接種后第19天起，每周檢測腫瘤體積。連續(xù)給藥4周后停藥一周，處死裸鼠，取移植瘤組織進(jìn)行CD34染色檢測各組微血管密度(MVD)。對照組與各治療組間移植瘤體積比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；對照組與各治療組間MVD的比較采用單因素方差分析； 2、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對荷瘤裸鼠皮下

13、移植瘤VEGF、Flt-1、KDR、ERK、Bcl-2、Bcl-xl的影響：分別將Bevacizumab、吉西他濱、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱及安慰劑作用于荷人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤，各組留取新鮮活組織標(biāo)本10％中性多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色后制備成免疫組化切片，采用標(biāo)準(zhǔn)EnVisionTM法進(jìn)行免疫組化流程染色； 3、WesternBlot檢測Bevacizu

14、mab聯(lián)合吉西他濱對荷人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤中ERK1/2、Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)的影響：分別將Bevacizumab、吉西他濱、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱及安慰劑作用于荷人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤，提取組織蛋白后，行WesternBlot檢測。 結(jié)論： 1、Bevacizumab與吉西他濱均可延緩腫瘤的生長，且Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱可顯著增加二者單藥的療效； 2、Bevac

15、izumab可抑制移植瘤新生血管的形成，聯(lián)合吉西他濱治療后的移植瘤組織中新生血管形成減少更為顯著； 3、Bevacizumab極有可能直接封閉VEGF，阻斷VEGF經(jīng)由VEGFR-2進(jìn)行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止腫瘤細(xì)胞中新生血管的生成； 4、應(yīng)用化療藥物后，ERK基因的表達(dá)被明顯抑制，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。無論化療藥物還是分子靶向藥物，均可以下調(diào)Bcl-2及Bcl-xl的表達(dá)，而當(dāng)兩藥聯(lián)合時(shí)，Bcl-2及Bcl-xl的表達(dá)下降更為明