貝伐單抗聯(lián)合順鉑對VEGF高表達的荷卵巢癌裸鼠腹水抑制作用的實驗研究.pdf

1、研究背景 卵巢癌具有腹膜內種植轉移的特征。研究證實血管滲透性因子(Vascular permeability factor，VPF)，又名血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)在卵巢癌腹水形成中起關鍵作用。惡性腹水通常是腫瘤的晚期表現(xiàn)。一旦發(fā)生，患者的中位生存期大約僅為數(shù)周至數(shù)月，而一年生存率一般不超過10％。現(xiàn)階段，針對惡性腹水的治療手段較多，包括全身化療、腹腔灌注化療

2、、放療、腹腔內注射放射性同位素或生物反應調節(jié)劑等。雖然獲得了一定療效，但是，迄今為止還沒有哪一種方法的療效完全令人滿意，同時往往還造成患者生存嚴重下降。因此，如何對這部分患者進行恰當?shù)呐R床干預以使其有較好的生存質量，是目前臨床腫瘤工作者面臨的重要任務。 癌性腹水的發(fā)生機制與肝硬化腹水的發(fā)生機制相比，有顯著的不同。在肝硬化腹水形成中，患者體內水鈉滁留、低蛋白血癥是造成腹水的主要原因；而對于癌性腹水，早先曾認為是膈下淋巴叢引流減少所

3、導致，但是近來的研究表明，腫瘤局部分泌的血管內皮生長因子(VEGF)，又名血管滲透性因子(VPF)，作用于腹膜及新生血管導致其通透性增強才是形成癌性腹水的主要原因。以VEGF為靶點，抑制新生血管形成和腹膜滲透性，減少腹水生成，可能成為治療癌性腹水的新策略。目的本研究擬建立VEGF高表達的荷卵巢癌裸鼠腹水模型，觀察貝伐單抗(抗-VEGF單克隆抗體)對卵巢癌腹水生成的抑制作用，并探討其作用機制。研究貝伐單抗(Bevaci Zumab)聯(lián)合化

4、療藥物順鉑(DDP)對裸鼠腹水生成的聯(lián)合效用，以其提高腹水治療的靶向性，尋找更有效的生物化療治療腹水的臨床方法。 實驗方法 1、對人卵巢癌細胞OVCAR3和HEY-A8腫瘤細胞株進行傳代培養(yǎng)，并用RT-PCR方法測定其細胞VEGF和OVCAR3細胞VEGFR的表達。 2、用兩種細胞株進行腹腔內接種，觀察腹水形成情況，用貝伐單抗和化療藥物順鉑對成腹水的裸鼠進行干預。 3、用ELISA法測定腹水中VPF/VE

5、GF的含量，用5％的Evan藍從裸鼠尾靜脈注入后，用酶標儀540nm波長檢測Evan藍的吸光度，通過檢測吸光度值間接反映Evan藍的濃度，從而分析腹膜滲透性。 4、用CD34抗體標記檢測微血管密度來研究貝伐單抗、順鉑對VEGF高表達的人卵巢癌細胞實體瘤血管生成的影響。 5、收集臨床腹水標本，用ELISA法測定腹水中VEGF 的含量，從臨床患者腹水中VPF/VEGF濃度的具體情況來進一步驗證VEGF 在腹水生成中的重要作用

6、。 6、統(tǒng)計學處理：動物實驗中的數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件中完全隨機設計資料的單向方差分析(One-way ANOVA)，多組間比較采用LSD法。臨床標本部分患者年齡、兩組患者腹水中VEGF含量采用獨立樣本t檢驗。 結果 l、OVCAR3和HEY-A8細胞的培養(yǎng)和鑒定。OVCAR3和HEY-A8細胞經過復蘇、傳代培養(yǎng)后，生長狀態(tài)良好，細胞成團塊生長，單個細胞體積大，OVCAR3細胞圓形透亮；HEY-A8呈分葉狀

7、，透光度非常好。分別用RT-PCR方法進行VEGF的定性檢測，結果表明OVCAR3細胞VEGF呈強陽性表達；HEY-A8不表達VEGF。2、兩種人卵巢癌細胞株裸鼠腹水模型的建立。分別用兩種細胞株進行腹膜內接種，裸鼠(5至7周齡)腹腔內注射OVCAR3細胞懸液(共48只，每只注射體積200ul，含5×10<'6>個細胞)。另外，將HEY-A8卵巢癌細胞株接種至12只裸鼠腹膜腔內(每只200ul，含2×10<'6>個細胞)，接種后觀察腹部膨

8、隆和體重變化。OVCAR3細胞種植后2周，裸鼠開始出現(xiàn)腹部膨隆，提示腹水形成。尸解后，OVCAR3裸鼠腹腔內可見腹水生成，并見腹膜、腸道、腸系膜和子宮的表面散在的瘤結節(jié)，而HEY-A8裸鼠無腹部膨隆等癥狀出現(xiàn)，無腹水形成。 3、貝伐單抗、順鉑和貝伐單抗聯(lián)合順鉑對裸鼠腹水瘤的作用。分別測定腹水體積、腹水中VEGF含量、腹膜滲透性(0D值)、腫瘤細胞和紅細胞數(shù)、及腹膜內實體瘤組織的微血管密度。實驗結果表明三個治療組對腹水皆有抑制作用

9、，貝伐單抗組，順鉑組，聯(lián)合治療組裸鼠腹水體積分別為：2.36±0.34，3.62±0.31，1.82±0.40；以貝伐單抗組和聯(lián)合治療組作用顯著，尤以聯(lián)合治療組效果明顯(p=0.000；p<0.05)；腹水中紅細胞和腫瘤細胞分別在10<'7>個/ml和10<'6>個/ml水平以上，對照組紅細胞為78.83±7.63，貝伐單抗組，順鉑組、聯(lián)合治療組分別為49.33±6.15，63.67±9.83，34.00±14.27，各治療組跟對照組相

10、比差異明顯，尤以聯(lián)合治療組差異顯著(p=0.000；p<0.05)；各治療組跟對照組相比，腹水中紅細胞明顯少于對照組(p=0.000；p<0.05)；對照組中腫瘤細胞為77.00±6.60；貝伐單抗組，順鉑組，聯(lián)合治療組分別為56.67±4.68，67.83±6.88，40.33±9.59，各治療組跟對照組相比差異明顯，尤以聯(lián)合治療組差異顯著(p=0.000；p<0.05)；貝伐單抗組、順鉑組、聯(lián)合治療組和對照組的腹水中VEGF濃度分別

11、為193.3±10.09、402.0±11.59、138.8±10.28和411.2±10.80，貝伐單抗組較順鉑組和對照組明顯減少腹水中VEGF含量；順鉑組和對照組之間無明顯差異(p=0.154，p>0.05)；而貝伐單抗和順鉑的聯(lián)合治療可加強對腹水中VEGF含量的抑制(p=0.000；p<0.05)。在腹膜滲透性方面，結果顯示貝伐單抗組腹膜滲透性的0D值明顯低于順鉑組和對照組(p=0.000；p<0.05)，順鉑組和對照組及貝伐單抗

12、組與聯(lián)合治療組之間無明顯差異(p=0.078；p>0.05)，說明貝伐單抗可明顯改善腹膜滲透性，順鉑對腹膜滲透性無明顯影響。4、貝伐單抗、順鉑和貝伐單抗聯(lián)合順鉑對腫瘤組織微血管密度的影響。實驗結果表明：對照組MVD的平均值為33.00±3.74；順鉑組MVD平均值為31.50±3.08；貝伐單抗治療組MVD平均值為21.67±2.73；聯(lián)合治療組MVD平均值為16.83±2.48。順鉑組和對照組之間無明顯差異(p=0.404，p>0.0

13、5)；貝伐單抗和聯(lián)合治療組之問顯著差異(p=0.000；p<0.05)；貝伐單抗和聯(lián)合治療組較對照組和順鉑組顯著降低其微血管密度(p=0.000；p<0.05)。 5、臨床患者腹水的VEGF含量說明VEGF在腹水形成中的關鍵作用。惡性腹水和非惡性腹水中VEGF水平分別為(1294.9±761.9)pg/ml、(224.6±198.6)Pg/ml，兩者具有顯著性差異(p=0.000；p<0.05)。 結論 l、高V

14、EGF 表達的OVCAR3及不表達的HEY-A8之間在致腹水能力上存在差異，可能與VEGF表達差異有關。 2、在OVCAR3腹水瘤模型中，經貝伐單抗，順鉑、貝伐單抗和順鉑聯(lián)合干預實驗表明，貝伐單抗聯(lián)合順鉑能顯著抑制裸鼠腹水的生長；減少腹水中的VEGF含量；降低腹膜滲透性及減少腹水中腫瘤細胞及紅細胞數(shù)，說明貝伐單抗和順鉑聯(lián)合治療可加強對腹水的控制。 3、貝伐單抗聯(lián)合順鉑可明顯減少卵巢癌組織的MVD水平，說明二者聯(lián)合可明顯抑