核糖核酸酶抑制因子（RI）對卵巢癌裸鼠移植瘤抑制作用研究.pdf

1、核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor，RI)是一種存在于細(xì)胞漿中的50KDa的酸性蛋白質(zhì)，具有保護(hù)細(xì)胞不受外來的胰RNuse侵襲的功能。RI的主要結(jié)構(gòu)是由7個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列組成，每個(gè)重復(fù)單位有57個(gè)氨基酸殘基，7個(gè)亮氨酸的重復(fù)單位有規(guī)律的環(huán)狀排列使N．末端、C．末端在空間結(jié)構(gòu)上較為接近。每個(gè)重復(fù)單位中又包括A、B兩種亮氨酸重復(fù)單位。同時(shí)RI富含亮氨酸及半胱氨酸。RI以極低的K<,i>值(4×10<'-1

2、4>Hmol/L)競爭性的抑制核糖核酸酶A(RNaseA)。并能與血管生成因子(angiogenin，Ang)更緊密的結(jié)合，Ang是由腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌的分子量為14.4KDa的蛋白質(zhì)，能顯著促進(jìn)腫瘤血管的生成，Ang與RNaseA有很高的同源性，而且二者有著極其相似的立體結(jié)構(gòu)，都可以與核糖核酸酶抑制因子(RI)結(jié)合，因此RI具有抑制新生血管生成的活性，從而可作為一種很有前景的抗腫瘤血管生成新藥。 惡性腫瘤是危害人類健康最

3、嚴(yán)重的疾病之一，其中卵巢癌是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，由于其組織類型較多，缺乏有效的早期診斷方法，且手術(shù)和放化療療效不佳，卵巢癌的5年生存率仍較低，成為嚴(yán)重威脅婦科腫瘤患者生命的惡性疾病。腫瘤生長、轉(zhuǎn)移有賴腫瘤血管形成。腫瘤血管形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的前提條件，血管持續(xù)生長為其供應(yīng)營養(yǎng)．臨床和實(shí)驗(yàn)證明，腫瘤在達(dá)到1～2衄的直徑或厚度后，此時(shí)如果沒有新生血管形成來供應(yīng)營養(yǎng)，腫瘤就不再增大，且新生血管形成是惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移的重要前提。所

4、以通過抑制腫瘤血管形成，就可以達(dá)到一定的治療目的。 基因治療實(shí)質(zhì)是將正?；?qū)肽[瘤細(xì)胞中代替突變或缺失的基因；或者將突變的基因剔除，使組織細(xì)胞恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)或功能。對于卵巢癌治療的最近探索中，抗腫瘤血管基因治療令人矚目，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及一些Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床病人研究中取得了一定的療效，有望成為繼卵巢癌手術(shù)、放化療之后一種全新有效的治療方法。核糖核酸酶抑制因子(RI)對Ang有明顯抑制作用，Ang出包括腫瘤組織的多種細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)血

5、管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成新生血管，所以RI有抗腫瘤效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示RI能抑制動(dòng)物體內(nèi)某些移植瘤的生長，如已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)RI基因的轉(zhuǎn)染對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長有明顯抑制作用，另外RI對小鼠黑色素瘤、肉瘤 S180、乳腺癌實(shí)體瘤生長亦有抑制作用。 本課題在已有對RI研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步拓展研究RI對卵巢腫瘤的抑制作用。本課題的目的是對RI基因進(jìn)行提取純化，進(jìn)而研究RI在卵巢癌抗腫瘤血管基因治療中的作用。 本課題的主要工作如下：

6、 一、核糖核酸酶抑制因子(RI)基因質(zhì)粒的提純及鑒定用重組質(zhì)粒(PLNCX-Ri)轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，成功轉(zhuǎn)化后，以SDS堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，聚乙二醇(PEG)沉淀法純化質(zhì)粒DNA。同法處理空質(zhì)粒載體(PLNCX)。通過瓊脂糖電泳檢測、UV-754型紫外分光光度計(jì)分析、鑒定RI基因提取純度、濃度。結(jié)果顯示出現(xiàn)了PLNCX-Ri和PLNCX目的條帶，而且DNA純度、濃度均符合實(shí)驗(yàn)要求。 二、卵巢癌裸鼠移植瘤模型

7、的建立和RI基因的治療分析選擇卵巢癌細(xì)胞株Skov3為實(shí)驗(yàn)對象，培養(yǎng)卵巢癌Skov3細(xì)胞，以裸鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取對數(shù)生長期細(xì)胞皮下注射裸鼠，建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。繼之對照組以空質(zhì)粒載體(PLNCX)為治療試劑，實(shí)驗(yàn)組以質(zhì)粒 DNA(PLNCX-ri)為治療試劑進(jìn)行皮下注射。對比觀察兩組裸鼠成瘤率、抑瘤率及成瘤時(shí)間，對比兩組腫瘤大小。免疫組織化學(xué)分析兩組RI基因的表達(dá)，HE染色對比觀察微血管密度。結(jié)果顯示注射RI基因的實(shí)驗(yàn)組與注射空