中藥復(fù)方協(xié)同順鉑抗卵巢癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)通過觀察抗癌中藥復(fù)方(CHMP)藥血清及其協(xié)同順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的形態(tài)、增殖以及凋亡的影響，試圖解釋CHMP在體外對(duì)當(dāng)前卵巢癌化療一線藥物順鉑(DDP)的增效作用。 (2)探討CHMP藥血清、DDP對(duì)SKOV3細(xì)胞株Fas/FasL介導(dǎo)的免疫逃逸的逆轉(zhuǎn)作用。 (3)建立裸鼠皮下卵巢癌移植瘤模型，觀察CHMP協(xié)同DDP在活體的抑瘤作用。 (4)系統(tǒng)觀察CHMP對(duì)DDP模型小鼠的造血系統(tǒng)和免疫功能

2、的影響，探討CHMP對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)與抗化療骨髓抑制作用機(jī)理。 (5)從與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡主要相關(guān)的Fas/FasL及TNFR死亡受體通路及Caspase的活化等凋亡過程中的關(guān)鍵步驟出發(fā)，研究CHMP、DDP體內(nèi)外對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。通過以上五部分實(shí)驗(yàn)，試圖闡述抗癌CHMP協(xié)同DDP抗卵巢癌的確切機(jī)制。 方法：(1)制備兩個(gè)補(bǔ)益及解毒化瘀復(fù)方(即CHMP1、CHMP2)顆粒藥血清：選用正常SD大鼠，分

3、為正常對(duì)照組、CHMP1組、CHMP2組、CHMP1、CHMP2按大、中、小三個(gè)不同劑量灌胃給藥，對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。一次給藥后1h、2h、3h，二次給藥后1h、2h、3h，于無菌條件下自下腔靜脈采血，制備不同時(shí)相、不同劑量的CHMP1、CHMP2血清。對(duì)藥血清進(jìn)行分組：CHMP1血清組，臨用前將CHMP1血清加入RPMI-1640培養(yǎng)液，濃度10％；CHMP2血清組，臨用前將CHMP2血清加入RPMI-1640培養(yǎng)液，濃度1

4、0％；對(duì)照組，用含10％正常大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配置，濃度10％；DDP組，用含10％正常大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配置，DDP終濃度為2μg/ml(小劑量)、10μg/ml(中劑量)、20μg/ml(大劑量)。MTT法測(cè)定各時(shí)相及不同劑量藥血清對(duì)SKOV3在24、48、72、96h細(xì)胞增殖的影響，以確定藥血清最佳時(shí)相及劑量。MTT法測(cè)定兩藥物相互作用指數(shù)(CDI)，觀察CHMP與DDP之間的協(xié)同作用。采用流式細(xì)胞

5、技術(shù)(FCM)分析對(duì)照組、CHMP1組、CHMP2組、DDP組、CHMP1+DDP、CHMP2+DDP組藥血清作用于SKOV3細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化，丫啶橙染色法及DNA瓊脂糖凝膠電泳法觀察上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡。 (2)制備CD3AK細(xì)胞：將外周血用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，制備好的單個(gè)核細(xì)胞中加入CD3McAb(終濃度為50ng/ml)、rhIL-2(終濃度為

6、50U/ml)，在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每2～3d換液一次，換液時(shí)補(bǔ)加CD3McAb及rIL-2，使CD3McAb及rIL-2終濃度與培養(yǎng)細(xì)胞的CD3McAb及rIL-2初始濃度相同。繼續(xù)作擴(kuò)增培養(yǎng)，4天后收集備用。使用血清藥理學(xué)方法，MTT法檢測(cè)對(duì)照組、CHMP1組、CHMP2組、DDP組、CHMP1+DDP組、CHMP2+DDP組CD3AK細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞殺傷作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面Fas/FasL分子和各實(shí)驗(yàn)組SK

7、OV3細(xì)胞對(duì)JurkatT細(xì)胞凋亡的影響。 (3)建立裸鼠人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3皮下移殖瘤模型。通過測(cè)定對(duì)照組、CHMP1組、CHMP2組、DDP組、CHMP1+DDP、CHMP2+DDP組腫瘤體積的變化，TUNEL檢測(cè)腫瘤組織凋亡以及HE染色，光鏡、電鏡下觀察腫瘤組織病理，評(píng)價(jià)在體內(nèi)中藥復(fù)方顆粒協(xié)同順鉑抗卵巢癌的作用。 (4)腹腔ipDDP小鼠(BALB/C)建立免疫抑制模型，分組同上，制備脾細(xì)胞，MTT法測(cè)定NK細(xì)

8、胞殺傷活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞亞群，HE染色觀察脾臟組織的病理學(xué)改變，檢測(cè)外周血白細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)。碳粒廓清法測(cè)定小鼠單核細(xì)胞的吞噬指數(shù)。 (5)Westernblot及比色法檢測(cè)上述各組SKOV3細(xì)胞TNFR1、caspase-3,8蛋白表達(dá)和活性改變，半定量RT-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞或瘤組織Fas/Fasl、TNFR1和A20mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：(1)CHMP1和CHMP2均在2t-1

9、時(shí)相藥血清抑制最好，用2t-1時(shí)相的藥血清培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，MTT測(cè)定各劑量組SKOV3細(xì)胞生長均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，藥物劑量與抑制作用大小無線性關(guān)系，以中劑量抑制作用最好，DDP隨劑量增加，對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率增高，以高劑量DDP抑制率最好。故以后的實(shí)驗(yàn)均選2t-1時(shí)相、中劑量CHMP1、CHMP2血清及高劑量DDP血清。CHMP1、CHMP2與DDP聯(lián)合作用，兩兩藥物之間有協(xié)同作用；SKOV3細(xì)胞經(jīng)對(duì)照組、CHMP1組、CH

10、MP2組、DDP組、CHMP1+DDP組、CHMP2+DDP組血清作用48h后，丫啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組SKOV3細(xì)胞呈均勻黃綠色熒光染色，而經(jīng)藥血清處理的各組細(xì)胞則可見細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染顆粒塊熒光凋亡細(xì)胞；各實(shí)驗(yàn)組血清作用卵巢癌細(xì)胞48h，瓊脂糖電泳就顯示出典型的凋亡梯度狀條帶；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組在0～96小時(shí)范圍內(nèi)，隨著時(shí)間延長，G0/G1期所占細(xì)胞比例逐漸增加，S及G2/M期細(xì)胞逐漸變少，說明

11、經(jīng)含藥血清作用后，主要阻滯SKOV3細(xì)胞于G0/1期，聯(lián)合用藥組對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響強(qiáng)于單獨(dú)用藥組。 (2)各組SKOV3細(xì)胞和JurkatT細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，對(duì)照組、DDP組、CHMP1組、CHMP2組DDP+CHMP1組、DDP+CHMP2組JurkatT細(xì)胞的凋亡率，表明藥血清可以顯著提高CD3AK細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷率(P＜0.01)。 (3)病理HE染色可見，對(duì)照組瘤細(xì)胞生長旺盛，腫瘤組織大量異型細(xì)

12、胞呈團(tuán)塊狀分布，核分裂相多，少量壞死(+)。CHMP2組腫瘤細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞密度和分裂相明顯降低。CHMP1+DDP組、CHMP2+DDP組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，大部分細(xì)胞壞死(++～++++)，可見腫瘤細(xì)胞殘影、炎細(xì)胞浸潤。電鏡下對(duì)照組可見瘤細(xì)胞生長活躍，核異型性明顯，核漿比例大，而游離核糖體豐富。聯(lián)合用藥組靶細(xì)胞改變出現(xiàn)時(shí)間早，程度重，主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為線粒體擴(kuò)張呈空泡狀或固縮，嵴和基質(zhì)消失；微絨毛腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、擴(kuò)張、細(xì)胞

13、空泡樣變性多見，而細(xì)胞膜變化不明顯。聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于單獨(dú)用藥組，P＜0.05. (4)脾臟HE染色顯示正常對(duì)照組的脾臟組織光鏡下見脾小梁，白髓排列整齊，淋巴小結(jié)未見增多，在小梁周圍及白髓之間可見脾索與血竇，結(jié)構(gòu)如常、豐富。模型組脾臟組織的紅髓和脾小體結(jié)構(gòu)多被破壞，甚至消失，鏡下有淤血灶，T、B淋巴細(xì)胞均減少，淋巴濾泡缺如，可見紅細(xì)胞被噬現(xiàn)象，含鐵血黃素沉積及灶性壞死?？勺C實(shí)免疫抑制小鼠造模成功。CHMP2聯(lián)合給藥脾臟

14、組織的紅髓和脾小體排列稍紊亂，T淋巴細(xì)胞略減少，可見含鐵血黃素沉積，無灶性壞死。脾臟組織的紅髓和脾小體排列稍紊亂，可見淋巴小結(jié)，結(jié)構(gòu)正常，未見壞死灶；CHMP1聯(lián)合給藥光鏡(高倍鏡)下可見脾細(xì)胞排列有序，紅髓內(nèi)可見大量巨噬細(xì)胞增生，白髓內(nèi)亦可見明顯密集增生的淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞，髓索和髓竇分布有序。大劑量的順鉑可使小鼠白細(xì)胞數(shù)降低、骨髓有核細(xì)胞數(shù)降低，與對(duì)照組相比均有顯著差異；體重降低，與對(duì)照組相比較有顯著差異；而CHMP1、CHMP2

15、與DDP聯(lián)合給藥的試驗(yàn)表明，CHMP1、CHMP2具有明顯抵抗DDP副反應(yīng)的作用。 (5)與對(duì)照組相比，CHMP聯(lián)合DDP干預(yù)下，SKOV3卵巢癌細(xì)胞的上述指標(biāo)均有不同程度的變化，表現(xiàn)為Fas及TNFR1表達(dá)升高而FasL表達(dá)降低，可使Caspase-8、Caspase-3活化，SKOV3卵巢癌細(xì)胞鋅指蛋白A20表達(dá)降低。CHMP可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞SKOV3的促凋亡基因Fas、TNFR1，下調(diào)抗凋亡基因FasL。DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞F

16、as有明顯的上調(diào)作用，DDP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞FasL的表達(dá)具有雙重作用。在發(fā)揮治療作用，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞FasL蛋白的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用。 結(jié)論：(1)CHMP藥血清均能抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。作用機(jī)制主要表現(xiàn)在大部分細(xì)胞被阻滯在DNA合成前期，抑制腫瘤細(xì)胞S、G2/M期的作用，使細(xì)胞停止于DNA的合成期或分裂末期，阻滯腫瘤細(xì)胞染色體的復(fù)制。與化療藥DD

17、P具有協(xié)同作用。 (2)CHMP藥血清、DDP對(duì)Fas/FasL介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞免疫逃逸的有逆轉(zhuǎn)作用。 (3)CHMP具有體內(nèi)抑瘤作用，改善荷瘤小鼠的一般狀況，增加體重，提高荷瘤小鼠的生命延長率，誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。CHMP2抑瘤作用優(yōu)于CHMP1，CHMP1在改善荷瘤鼠的生存質(zhì)量方面優(yōu)于CHMP2，二者與DDP聯(lián)合應(yīng)用后可顯著提高療效。 (4)CHMP對(duì)化療藥物(DDP)有減毒作用，能使免疫抑制性小鼠一般狀