黃芪甲苷、β-欖香烯抗肝癌作用及其免疫機制的研究.pdf

1、目的：1．通過體外研究觀察黃芪甲苷、β-欖香烯對小鼠肝癌細胞的增殖抑制作用，以及對小鼠巨噬細胞(Mφ)、樹突狀細胞(DC)免疫功能的影響，同時觀察黃芪甲苷與β-欖香烯聯(lián)用后是否具有增效作用，探討黃芪甲苷、β-欖香烯對肝癌細胞的增殖是否有抑制作用，同時是否能夠增強小鼠Mφ及DC的免疫功能。2．通過體內(nèi)研究觀察黃芪甲苷、β-欖香烯及其聯(lián)用對小鼠細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α變化的影響，探討黃芪甲苷、β-欖香烯是否能夠增強小鼠機體的

2、免疫功能，同時兩者聯(lián)用是否有增效作用。3．通過體內(nèi)研究觀察黃芪甲苷、β-欖香烯及其聯(lián)用對肝癌荷瘤小鼠皮下移植瘤生長的抑制作用，并檢測實驗小鼠的T淋巴細胞表型和脾細胞IFN-γ、IL-4的表達，探討黃芪甲苷、β-欖香烯對肝癌荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響及抗腫瘤作用。
　　 方法：體外研究：培養(yǎng)小鼠肝癌細胞株BNL-75，分別用不同濃度黃芪甲苷、β-欖香烯、塞來昔布處理后用CCK-8試劑盒進行細胞生長抑制實驗，計算抑制率；培養(yǎng)小鼠Mφ株J

3、447A.1，取對數(shù)生長期細胞分空白組（陰性對照）、黃芪甲苷組、β-欖香烯組和聯(lián)合組（黃芪甲苷+β-欖香烯），收集經(jīng)藥物處理24h后的4組細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD86的表達，ELISA法檢測細胞上清中TNF-α、IL-1β含量，Griess方法檢測細胞上清NO的表達；體外培養(yǎng)小鼠DC株D2SC，取對數(shù)生長期細胞分空白組、脂多糖(LPS)組、黃芪甲苷組、β-欖香烯組和聯(lián)合組（黃芪甲苷+β-欖香烯），

4、收集經(jīng)藥物處理24h后的5組細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD80、CD86的表達，ELISA法檢測細胞表面IL-6、IL-12的表達。體內(nèi)研究：C57小鼠隨機分為黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組，空白對照組，每組6只，每日一次灌胃，空白對照組給予生理鹽水，每次500μl;黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組給予相應藥液，每次各組給藥濃度100μg/ml，500μl，分別在給

5、藥第7、14、21天小鼠眼球后靜脈取血離心，分離血清，ELISA法檢測小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量；建立肝癌皮下移植瘤模型，取建瘤成功的24只肝癌荷瘤小鼠，隨機分為黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組，空白對照組，每組6只，予建瘤成功次日連續(xù)每日一次灌胃，空白對照組給予生理鹽水，每次500μl;黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組給予相應藥液，每次各組給藥濃度100μg/ml，500μl，

6、連續(xù)給藥15天，具體分組為：空白對照組（正常小鼠）、實驗對照組（荷瘤小鼠）、實驗組（黃芪甲苷、β-欖香烯灌胃后的荷瘤小鼠），觀察腫瘤生長情況，停藥次日處死取脾，流式細胞儀檢測脾細胞CD4、CD8的表達。
　　 結(jié)果：體外研究：黃芪甲苷、β-欖香烯對肝癌腫瘤細胞生長有明顯抑制作用，同時兩者聯(lián)用具有協(xié)同增效作用。與空白組相比，黃芪甲苷、β-欖香烯處理后Mφ表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD86分子的表達水平均顯著提高(p＜0.0

7、1，p＜0.05)，其中聯(lián)合處理后MHCⅡ、CD40、CD86表達明顯高于黃芪甲苷組(p＜0.05)，MHCI表達明顯高于β-欖香烯組(p＜0.05)。隨著黃芪甲苷、β-欖香烯濃度及作用時間的增加，Mφ吞噬中性紅的能力逐漸升高，100μg/ml的濃度作用24h后吞噬能力最佳，兩者聯(lián)用時有協(xié)同增效作用。不同濃度黃芪甲苷、β-欖香烯處理后Mφ上清TNF-α、IL-1β、NO的表達水平均高于空白組，100μg/ml濃度時有統(tǒng)計學意義(p＜0.

8、01，p＜0.05)，且各組表達水平均隨著加藥濃度的增加而提高；同一濃度聯(lián)合組表達TNF-α、IL-1β、NO均高于單用中藥組，黃芪甲苷組與β-欖香烯組無明顯差別；與單用黃芪甲苷或單用β-欖香烯相比，100μg/ml濃度的聯(lián)用組TNF-α、IL-1β、NO的表達明顯升高(p＜0.05）。與空白組、LPS組比較，黃芪甲苷、β-欖香烯及其聯(lián)合處理后的D2SC細胞表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD80、CD86分子的表達水平均顯著提高(p

9、＜0.01，p＜0.05)；與單用黃芪甲苷或單用β-欖香烯相比，黃芪甲苷與β一欖香烯聯(lián)合處理后MHCⅡ、MHCI、CD40、CD80、CD86分子表達水平明顯升高，部分有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）。黃芪甲苷、β-欖香烯處理后的D2SC細胞表面細胞因子IL-12、IL-6的表達水平均高于空白組與LPS組，其中黃芪甲苷組、β-欖香烯組處理后IL-12、IL-6表達明顯高于LPS組(p＜0.05)，聯(lián)合組處理后IL-12、IL-6表達顯著高于

10、LPS組（p＜0.01）；與單用黃芪甲苷組或單用β-欖香烯相比，黃芪甲苷、β-欖香烯聯(lián)合處理后IL-12、IL-6表達明顯升高（p＜0.05）。體內(nèi)研究：黃芪甲苷、β-欖香烯及聯(lián)合灌胃后小鼠體內(nèi)IL-2、IFN-γ、TNF-α的表達水平明顯高于空白組(p＜0.01,p＜0.05)，且各組表達水平均隨著灌胃天數(shù)的增加而提高；與單用黃芪甲苷或單用β-欖香烯灌胄相比，聯(lián)合組小鼠灌胃后第21天體內(nèi)IL-2、IFN-γ、TNF-α的表達明顯升高(

11、p＜0.05）。黃芪甲苷、β-欖香烯對肝癌荷瘤小鼠灌胃15天后，3組實驗組小鼠皮下腫瘤生長趨勢較生理鹽水組明顯緩慢，聯(lián)合組在灌胃10天后腫瘤縮小趨勢更加明顯。與空白對照組比較，實驗對照組及實驗組小鼠T細胞數(shù)量均有明顯下降；與實驗對照組比較，實驗組小鼠T細胞數(shù)量明顯增多，與單個中藥組比較，聯(lián)合組小鼠T細胞數(shù)量增多。荷瘤小鼠經(jīng)中藥治療后，CD4+/CD8+比例增高，聯(lián)合用藥組顯著增高，CD4+/CD8+＞1(p＜0.05)。中藥治療后荷瘤小

12、鼠脾細胞IFN-γ、IL-4的表達水平均高于對照組，其中黃芪甲苷組、β一欖香烯組IFN-γ、IL-4表達明顯高于對照組(p＜0.05），聯(lián)合組IFN-γ、IL-4表達顯著高于對照組(p＜0.01)；與單用黃芪甲苷組或單用β-欖香烯治療相比，黃芪甲苷、β-欖香烯聯(lián)合治療荷瘤小鼠后IFN-γ、IL-4表達明顯升高(p＜0.05）。
　　 結(jié)論：1、黃芪甲苷、β-欖香烯對肝癌細胞的生長有明顯抑制作用，對肝癌荷瘤小鼠有明顯抑瘤作用，同時