告達(dá)庭抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及對缺血性腦卒中的保護作用.pdf

1、目的:
　　1、探討告達(dá)庭體外抑制3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的效果及分子機制。
　　2、研究告達(dá)庭對缺血性腦卒中小鼠的治療作用及機制。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞（U251）、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（U87）、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6）。待細(xì)胞貼壁后將各細(xì)胞株隨機分為對照組、用藥組（不同劑量—100μM、50μM、25μM的告達(dá)庭）。相差顯微鏡觀察告達(dá)庭不同濃度下各細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)及密度的變化；

2、MTT檢測法檢測不同濃度告達(dá)庭干預(yù)下各細(xì)胞株的活性改變；流式細(xì)胞儀測定分析各細(xì)胞株細(xì)胞周期的變化；JC-1及DCFH-DA染色方法，檢測細(xì)胞膜電位變化及細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積；Werstern blotting方法進(jìn)一步研究告達(dá)庭抑制腦膠質(zhì)瘤生長的分子機制。
　　2、采用線栓法制備右側(cè)昆明小鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型。實驗用小鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組和告達(dá)庭治療組。在小鼠手術(shù)成功完成并經(jīng)過不同干預(yù)因素處理后1d，2d，3d，采

3、用Zea Longa評分法、足失誤試驗及圓筒實驗對各處理組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分；3d后TTC染色及相關(guān)軟件分析觀察小鼠大腦腦梗死灶，測定梗死體積；干濕重稱量的方法檢測小鼠大腦組織含水量；免疫熒光染色法檢測缺血側(cè)腦組織中MPO、AQP4含量的改變。
　　結(jié)果:
　　1、相差顯微鏡觀察三種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，經(jīng)過不同濃度（100μM、50μM、25μM）的告達(dá)庭干預(yù)的U251、U87及C6細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化

4、，細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞突起明顯減少。MTT結(jié)果顯示，告達(dá)庭對三種腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長均起到抑制作用，且這種抑制作用隨濃度及時間的增加而增加，呈劑量依賴性和時間依賴性，與正常細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對細(xì)胞進(jìn)行PI染色，流式細(xì)胞儀測定分析各細(xì)胞株細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示：對于不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，告達(dá)庭展現(xiàn)了不同的周期阻滯作用，對U251細(xì)胞株起到了G0/G1期阻滯，在U87細(xì)胞株中呈S期阻滯。對U251及C6細(xì)胞進(jìn)行JC-1

5、及DCFH-DA染色，結(jié)果顯示，告達(dá)庭干預(yù)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量增加，且增加的趨勢呈劑量依賴性。Werstern blotting結(jié)果表明，經(jīng)過告達(dá)庭干預(yù)的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)周期蛋白D1和AKT隨告達(dá)庭濃度的增加呈下降趨勢，Ser15-p53和Ser139-H2A含量隨濃度的增加呈上升趨勢，增加或下降的趨勢呈劑量依賴性，而ERK、p38及JNK1/2的表達(dá)呈輕微下降，下降趨勢不明顯。
　　2、腦缺血模型建立1

6、d，2d，3d不同時間點，與模型組相比告達(dá)庭治療組的小鼠神經(jīng)功能缺損情況均得到顯著改善，告達(dá)庭治療組與模型組相比，行為學(xué)評分具有明顯差異，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TTC染色結(jié)果顯示在MCAO后3d，告達(dá)庭治療組的腦梗死體積較模型組降低。在MCAO后3d，告達(dá)庭治療組的腦組織含水量較模型組明顯減少。通過免疫熒光染色法對腦組織中MPO的浸潤情況進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織中可見少量的散在分布的MPO+細(xì)胞，模型組MPO+細(xì)胞

7、在腦缺血3d時向腦部浸潤明顯，告達(dá)庭治療組中MPO+細(xì)胞數(shù)明顯降低。同時對腦缺血3d時各治療組的AQP4表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明告達(dá)庭治療組AQP4陽性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著降低。
　　結(jié)論:
　　1、高濃度的告達(dá)庭可通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)出、DNA損傷，同時伴隨MAPKs/AKT通路的異常表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，且這種抗腫瘤作用呈劑量及時間依賴性。
　　2、腹腔注射告達(dá)庭對小鼠腦缺血起到一定的保