RNA干涉抑制hTERT對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為三部分： 第一部分：靶向hTERT小片段干涉RNA表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) 目的:構(gòu)建靶向hTERT的小片段RNA(siRNA)表達(dá)載體，為研究RNA干涉(RNAi)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)抑制靶基因表達(dá)奠定基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的原則運(yùn)用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)靶序列并合成其表達(dá)框，連接入質(zhì)粒載體pRNAT-H1.1/Neo，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光定量RT-PCR和western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞

2、中hTERT表達(dá)。 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定證明hTERT siRNA轉(zhuǎn)錄模板完整、正確插入到pRNAT-H1.1/Neo質(zhì)粒中，并篩選出一個(gè)抑制hTERT表達(dá)效率最高的序列，其hTERT表達(dá)僅達(dá)22.90％。 結(jié)論:成功構(gòu)建并篩選出一個(gè)抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表達(dá)載體，為以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分：靶向hTERT siRaNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 目的

3、:通過(guò)構(gòu)建靶向人端粒酶催化亞基(hTERT)RNAi慢病毒載體，獲得可供轉(zhuǎn)染的滴度，為下一步研究該基因缺陷在真核細(xì)胞中的影響提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)：hTERT設(shè)計(jì)的兩條互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸退火后形成雙鏈插入到pLVTHM質(zhì)粒，生成含RNAi盒的載體，然后與pCMV-dR8.74和pMD2G病毒包裝所必須的元件經(jīng)脂質(zhì)體導(dǎo)入T293細(xì)胞，包裝成慢病毒，收集上清濃縮病毒并檢測(cè)其滴度。RT-PCR檢測(cè)干擾后細(xì)胞內(nèi)hTERT表達(dá)變化。

4、 結(jié)果:將目的序列成功連接到載體上，并經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)載體構(gòu)建成功；成功包裝成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP檢測(cè)結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的hTERT-siRNA慢病毒表達(dá)載體可顯著抑制hTERT基因的表達(dá)和端粒酶活性。 結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶靶向hTERT基因的RNAi慢病毒載體。該載體能夠有效抑制hTERT的表達(dá)和端粒酶活性，為以hTERT為靶點(diǎn)的膠質(zhì)瘤基因治療的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分：慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)抑制

5、hTERT表達(dá)對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用研究 目的:觀測(cè)利用RNAi技術(shù)下調(diào)hTERT表達(dá)對(duì)U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。 方法:將慢病毒為載體的靶向hTERT siRNA構(gòu)建體-Lt-I感染u87細(xì)胞，含無(wú)效序列的慢病毒Lt-non作為空載對(duì)照，正常培養(yǎng)U87細(xì)胞作為陰性對(duì)照。RT-PCR檢測(cè)hTERT表達(dá)，TRAP法檢測(cè)端粒酶表達(dá)，MTT和流式細(xì)胞檢測(cè)分析細(xì)胞增殖和周期變化，熒光原位雜交檢測(cè)端粒長(zhǎng)度變化，Transwel