氨基脲對斑馬魚(Danio rerio)抗雌激素效應(yīng)研究.pdf

1、氨基脲是硝基呋喃類藥物(如呋喃西林)的特征性代謝產(chǎn)物，同時也是塑料發(fā)泡劑偶氮二甲酰胺的高溫分解產(chǎn)物，曾在動物源性食品、玻璃包裝食品中被檢測到。由于氨基脲對大鼠具有中等急性毒性，且具有潛在的致癌性、神經(jīng)毒性、抗雌激素作用等多種毒性效應(yīng)，歐盟對動物源性食品中氨基脲殘留的限量為1.0μg/kg，我國羅非魚、鰻魚等出口水產(chǎn)品多次被檢出氨基脲超標(biāo)，嚴(yán)重影響了我國出口水產(chǎn)品質(zhì)量。近期，我國東營潮河入?？卩徑Ｓ蛞褭z測到了氨基脲污染，海水中達(dá)到46.

2、41μg/L，而貝類中達(dá)到6.46μg/kg，遠(yuǎn)超歐盟限量?？梢姲被遄鳛橐环N全新的海洋污染物正在威脅著我國的海洋生態(tài)環(huán)境。但目前氨基脲對水生生物的毒性作用還缺乏研究。因此，本論文檢測了氨基脲水體暴露對斑馬魚的急性毒性，并從內(nèi)分泌干擾角度研究了氨基脲的抗雌激素效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制，以對氨基脲的海洋生態(tài)風(fēng)險評估以及水產(chǎn)品安全控制提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　本文的研究結(jié)果如下：
　　(1)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氨基脲對成年斑馬魚

3、的96h半數(shù)致死濃度LC50為26.29mg/L，95％置信區(qū)間為24.42~27.78mg/L。根據(jù)HJT154-2004《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》，氨基脲屬于中毒類化學(xué)物質(zhì)。
　　(2)類雌激素效應(yīng)檢測：本文采用雄魚中卵黃原蛋白基因 vtg-1及其受體基因ERα、ERβ的表達(dá)作為雌激素效應(yīng)的生物標(biāo)志物，首先檢測了氨基脲是否具有類雌激素效應(yīng)。以1.0、10.0、100.0、1000.0μg/L的氨基脲水體暴露雄性斑馬魚96h和2

4、8天后，各處理組vtg-1、ERα、ERβmRNA表達(dá)量較對照組均無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在暴露時間內(nèi)，氨基脲不能誘導(dǎo)雄性斑馬魚肝臟內(nèi)vtg-1及雌激素受體基因的表達(dá)，無類雌激素效應(yīng)。
　　(3)抗雌激素效應(yīng)檢測：雌魚體內(nèi)的雌激素經(jīng)過ERs介導(dǎo)，可誘導(dǎo)肝臟合成VTG，抗雌激素類物質(zhì)能拮抗這一誘導(dǎo)作用，造成vtg-1基因表達(dá)的下降。因此本文以1.0、10.0、100.0、1000.0μg/L的氨基脲水體暴露性成熟的雌性斑馬魚96h

5、及28d后，檢測了斑馬魚肝臟vtg-1及ERs mRNA的變化。結(jié)果顯示暴露96h后，隨著氨基脲濃度的增高，斑馬魚肝臟vtg-1表達(dá)水平較對照組不斷下降；暴露28天后，各處理組vtg-1表達(dá)水平及性腺指數(shù)均進(jìn)一步極顯著下降，表明氨基脲能夠抑制雌性斑馬魚肝臟vtg-1的表達(dá)，具有明顯的抗雌激素效應(yīng)。對ERs的檢測表明，暴露96h造成所有處理組的ERα與ERβmRNA水平顯著下降，且ERαmRNA的降低具有劑量效應(yīng)；暴露28d造成所有處理組

6、ERα與 ERβmRNA進(jìn)一步極顯著降低。結(jié)果說明，氨基脲可能通過抑制雌激素受體的表達(dá)來阻遏內(nèi)源雌激素發(fā)揮雌激素活性。
　　(4)氨基脲抗雌激素效應(yīng)的活性檢測：500ng/L的E2分別與1.0μg/L、10.0μg/L、100.0μg/L、1000.0μg/L的氨基脲聯(lián)合暴露雄性斑馬魚96h后，1000.0μg/L氨基脲與500ng/L E2聯(lián)合暴露組的vtg-1較E2處理組相比極顯著下降，接近空白對照組，提示1000.0μg/L

7、氨基脲能完全拮抗500ng/L E2的雌激素活性，拮抗E2的能力約為兩千分之一，表現(xiàn)為弱的抗雌激素效應(yīng)。而1.0μg/L、10.0μg/L、100.0μg/L三個濃度氨基脲與E2聯(lián)合暴露組vtg-1及ERαmRNA表達(dá)水平均高于空白對照，甚至高于E2單獨(dú)暴露組，原因可能是短期暴露時，雄性斑馬魚對低濃度氨基脲的抗雌激素效應(yīng)具有代償作用，造成ERα及vtg-1表達(dá)的短期升高。延長暴露時間至28天后，所有聯(lián)合暴露組的vtg-1、ERα、ERβ

8、mRNA表達(dá)水平均較E2處理組出現(xiàn)極顯著下降，且各組的vtg-1、ERαmRNA表達(dá)水平均接近空白對照，1000.0μg/L的氨基脲聯(lián)合暴露組的ERβmRNA也接近空白對照。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)氨基脲具有弱的抗雌激素效應(yīng)。
　　綜上所述，本文研究結(jié)果表明氨基脲對成年斑馬魚的96h半數(shù)致死濃度LC50為26.29mg/L，屬于中毒類化學(xué)物質(zhì)。氨基脲不具有類雌激素效應(yīng)，而具有明顯的弱抗雌激素效應(yīng)，96h時拮抗能力約為E2的兩千分之一。其拮