EE2損傷雌性斑馬魚成魚(Danio rerio)卵巢、肝臟和鰓的機(jī)理研究.pdf

1、環(huán)境雌激素廣泛存在于自然水體中，對(duì)長(zhǎng)期生活在水中的魚類影響巨大。但現(xiàn)有的研究主要集中于環(huán)境雌激素對(duì)魚類早期的胚胎發(fā)育、性別分化以及雄魚性腺發(fā)育的影響，而對(duì)雌魚卵巢發(fā)育的研究較少。因此，本研究選取典型的環(huán)境雌激素EE2（17α-Ethynylestradiol）對(duì)模式動(dòng)物斑馬魚（Danio rerio）雌性成魚進(jìn)行了6天暴露處理。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組（100 ng/L EE2）卵巢中卵黃生成中期（MV期）卵母細(xì)胞內(nèi)容物減少，成熟期（F

2、G期）卵母細(xì)胞閉鎖；而低劑量組（20 ng/L EE2）卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生正常。為了闡明EE2損傷斑馬魚卵巢的分子機(jī)制，本研究采用定量 PCR方法，分析了EE2對(duì)雌性斑馬魚成魚腦-垂體-性腺軸中參與性類固醇合成重要基因的表達(dá)水平的影響。定量結(jié)果表明，高劑量的EE2暴露使腦中cyp19a1b、gnrh-II和垂體中GnRH受體gnrhr-II的表達(dá)均顯著下調(diào)，這可能會(huì)抑制垂體中促卵泡生成素（FSH）和促黃體生成素（LH）的合成。垂體中定量

3、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH亞基fshβ和LH亞基lhβ的表達(dá)均顯著下調(diào)，暗示垂體中 FSH和 LH合成降低，這與我們的猜測(cè)一致。不僅垂體中兩種促性腺激素合成降低，在卵巢中FSH和LH各自的受體fshr、lhr的表達(dá)也顯著下調(diào)，這可能會(huì)抑制卵巢中 E2（17β-Estradiol）合成關(guān)鍵基因 cyp19a1a和 DHP（17a,20bdihydroxy-4-pregnen-3-one）合成關(guān)鍵基因20β-hsd-II的表達(dá)。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的

4、表達(dá)均顯著下調(diào)，暗示卵巢中E2和DHP的合成減少，進(jìn)而可能會(huì)下調(diào)血漿中E2和DHP的水平。本研究測(cè)定了雌性斑馬魚血清中E2的水平，發(fā)現(xiàn)高劑量的EE2處理能顯著降低血漿中E2（17β-Estradiol）水平，這與上文的推測(cè)結(jié)果一致。雖然，本研究未測(cè)定血漿中DHP的水平，但我們有理由推測(cè)血漿中DHP的水平也會(huì)降低。此外，不僅血漿中E2水平降低，其在卵巢中的效應(yīng)原件erα的表達(dá)也顯著降低，這可能會(huì)導(dǎo)致E2不能誘導(dǎo)MV期卵母細(xì)胞完成卵黃積累，

5、進(jìn)而導(dǎo)致該時(shí)期卵母細(xì)胞內(nèi)容物減少。而DHP的合成不足可能會(huì)導(dǎo)致FG期卵母細(xì)胞喪失成熟的能力，進(jìn)而誘導(dǎo)其閉鎖，并進(jìn)入凋亡階段。上述推測(cè)與我們組織學(xué)結(jié)果完全一致。綜上，我們認(rèn)為：100ng/L EE2暴露導(dǎo)致雌性斑馬魚成魚卵子發(fā)生受阻，與腦-垂體-性腺軸中眾多參與雌激素和孕激素合成的重要基因及雌激素效應(yīng)原件的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)還初步探究了EE2對(duì)雌性斑馬魚肝臟的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)EE2能誘導(dǎo)肝臟中erα和vtg的表達(dá)。

6、　　在EE2對(duì)雌性斑馬魚的生殖毒性研究中，我們還發(fā)現(xiàn)，高劑量組雌魚體色暗淡，背部鱗片豎起，鰓絲充血，腹腔積水，肝臟腫大；而低劑量組并無(wú)上述現(xiàn)象，我們推測(cè)可能跟EE2誘導(dǎo)的雌性斑馬魚肝臟和鰓的氧化脅迫有關(guān)。因此，我們分析了EE2暴露后斑馬魚鰓和肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化及鰓和肝臟中抗氧化系統(tǒng)酶活性（SOD、CAT、GPx）及脂質(zhì)過氧化水平指標(biāo)MDA的含量。結(jié)果表明，低劑量組肝細(xì)胞間隙變大，部分鰓小片脫落。高劑量組肝細(xì)胞排列混亂，核仁萎縮，并呈現(xiàn)

7、大量空泡化；鰓小片融合并大量脫落，部分鰓小片上皮脫落，鰓絲血管萎縮變形。與對(duì)照組相比，低劑量組肝臟中GPx的活性在暴露后3天顯著下降，但隨后恢復(fù)正常，而SOD和CAT的活性及MDA的含量均無(wú)顯著變化；鰓中SOD活性先下降后恢復(fù)正常。同時(shí)，GPx的活性在第3天和6天均顯著下調(diào)，而CAT的活性及MDA的含量均無(wú)顯著變化。高劑量組肝臟中GPx的活性先下降后恢復(fù)正常，而SOD和CAT的活性隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著降低，但MDA的含量顯著增加。在

8、鰓中，SOD、CAT和GPx的活性在暴露后第3天和6天均顯著下降，但MDA的含量顯著上升。因此，以上結(jié)果表明，低劑量EE2暴露后，斑馬魚肝臟和鰓均未受到嚴(yán)重的氧化損傷，而高劑量暴露后肝臟和鰓受到了較為嚴(yán)重的氧化脅迫，這與本研究的組織學(xué)觀察結(jié)果一致。此外，我們研究還發(fā)現(xiàn)，高劑量EE2暴露后，斑馬魚鰓中Na+/K+-ATPase活性受到顯著抑制，結(jié)合鰓的組織病理學(xué)結(jié)果，我們推測(cè)，EE2可能會(huì)影響魚體的滲透壓調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致雌性斑馬魚腹腔積水。