斑馬魚Ror2對(duì)匯聚延伸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)理的研究.pdf

1、Ror2(The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor)是RTKs家族中的一員,為單次跨膜受體,在人類的骨骼發(fā)育和癌癥發(fā)生中發(fā)揮了十分重要的作用。在哺乳動(dòng)物例如小鼠中,Ror2突變體小鼠呈面部畸形,四肢和尾部短小,呼吸系統(tǒng)功能障礙,最終導(dǎo)致新生小鼠致死。在爪蛙中的研究發(fā)現(xiàn),XRor2及其突變體干擾了原腸期的匯聚延伸運(yùn)動(dòng)。因此,Ror2在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用,所以我們利

2、用斑馬魚胚胎體外發(fā)育及早期透明等優(yōu)勢(shì),對(duì)Ror2在早期胚胎發(fā)育中的功能進(jìn)行深入研究。前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),Ror2在小鼠和爪蛙中作為一類非Frizzled受體,能夠與Wnt5a相互作用調(diào)節(jié)CE運(yùn)動(dòng)。
　　匯聚延伸(CE)運(yùn)動(dòng)是原腸胚期的一種重要的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)形式,在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了十分重要的作用。值得注意的是,多種遺傳學(xué)證據(jù)強(qiáng)調(diào)了在斑馬魚胚胎原腸胚期調(diào)節(jié)CE運(yùn)動(dòng)的重要性。雖然Ror2在小鼠和爪蛙中能夠與Wnt5a相互作用調(diào)

3、節(jié)CE運(yùn)動(dòng),然而斑馬魚中,Wnt5a在原腸胚時(shí)期的表達(dá)量很低,而且Wnt5a敲降后也沒(méi)有引起CE缺陷的表型。然而斑馬魚中Wntll的突變體slb顯示了缺陷的CE運(yùn)動(dòng),之前的研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚Wntll能夠與Frizzled-7和Flamingo相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng),那么斑馬魚中Wntll是否能通過(guò)Ror2發(fā)揮功能呢?Hiroki Hikasa等研究表明XRor2與XWntll,Xfz7的共過(guò)表達(dá)能夠協(xié)同抑制匯聚延伸運(yùn)動(dòng)。生化實(shí)驗(yàn)表明,XR

4、or2的胞外結(jié)構(gòu)域CRD能夠與XWntll相結(jié)合,這一研究結(jié)果為我們提供了一些信息,但是并未有研究報(bào)道Wntll和Ror2體內(nèi)的相互作用功能。因此,以上的論述使我們提出了一些疑問(wèn),在斑馬魚中Ror2是否能夠在CE運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮功能?Wntll對(duì)CE運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用是否是通過(guò)Ror2的介導(dǎo)?Ror2與Wntll是否能夠相互結(jié)合?這些問(wèn)題目前還沒(méi)有得到解答。本研究的目的就是對(duì)上述疑問(wèn)依次進(jìn)行探討。
　　我們首先克隆得到了斑馬魚的Ror2基因

5、,通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)斑馬魚Ror2與人、小鼠和爪蛙的Ror2同源性極高。通過(guò)RT-PCR分析顯示,Ror2為母源性基因,且隨后的各胚胎時(shí)期均有表達(dá),并且值得一提的是,Ror2在6-9hpf表達(dá)量較高,這暗示著Ror2有可能在原腸胚期發(fā)揮作用。Ror2的過(guò)表達(dá)抑制了胚胎在原腸胚期的匯聚和遷移,導(dǎo)致了嚴(yán)重的CE缺陷表型,暗示著Ror2在原腸胚期的CE運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。
　　Ror2和Wntll共過(guò)表達(dá)能協(xié)同加強(qiáng)CE缺陷表型,并

6、且原位雜交markers(hgg、dlx3b、ntl)檢測(cè)也證明了這一結(jié)果,這暗示著斑馬魚Wntll可能通過(guò)Ror2調(diào)節(jié)CE運(yùn)動(dòng)。Ror2 Mos敲降實(shí)驗(yàn)顯示,在原腸胚期Ror2敲降后并沒(méi)有導(dǎo)致CE缺陷,產(chǎn)生這一結(jié)果的原因,我們猜測(cè)是由于胚胎中存在Rot2的母源性蛋白,而TBMO并不能將其母源性蛋白封閉住,因此敲降表型不明顯。所以,我們隨后又改用Ror2 dominant negative形式Ror2-TM進(jìn)行敲降。結(jié)果顯示,dnRor

7、2能夠?qū)е螺^為嚴(yán)重的CE缺陷,并且隨后的時(shí)期胚胎眼部間距變窄,甚至出現(xiàn)獨(dú)眼表型,表型與Wntll/silberblick突變體表型類似,暗示著斑馬魚Wntll可能會(huì)通過(guò)Ror2調(diào)控CE運(yùn)動(dòng)。因此我們同樣將Wntll MO和dnRor2進(jìn)行低劑量共顯微注射,結(jié)果同樣表明兩者的協(xié)同加成作用,并且進(jìn)一步暗示了Wntll與Ror2的相互作用。而Wntll mRNA與dnRor2共過(guò)表達(dá),顯著削弱了WntllmRNA引起的CE缺陷的表型,這一研究

8、從另一方面暗示了兩者的相互作用性。因此為了直接證明這一假設(shè),我們運(yùn)用CO-ip實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果也證明了Wntll的確能夠與Ror2相結(jié)合。為了進(jìn)一步研究Wntll通過(guò)Rot2調(diào)控CE運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的位點(diǎn),我們構(gòu)建了Rot2突變體,結(jié)果表明Ror2-Y647和-S863位點(diǎn)均能在此過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　通過(guò)以上研究表明,在斑馬魚中,Wntll能夠與Ror2結(jié)合,從而調(diào)控了原腸胚期的匯聚延伸運(yùn)動(dòng),而且這一調(diào)控作用中Ror2的