SUN1-2對斑馬魚集中延伸運動的調節(jié)及其機制的研究.pdf

1、SUN結構域蛋白（SAD1/UNC84 domain containing protein）是一類C端含有保守SUN結構域的蛋白，該結構域與釀酒酵母中的SAD1蛋白和線蟲中UNC-84蛋白有很高的同源性。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)的SUN結構域蛋白至少有四個，包括SUN1、SUN2、SUN3和SPAG4。其中SUN1和SUN2在哺乳動物各組織中廣泛表達，SUN3和SPAG4表達較少。在結構上，哺乳動物中SUN1和SUN2蛋白的N端均定位于

2、細胞核內，與核纖層蛋白相互連接，而其包含SUN結構功能域的C端則定位于雙層核膜之間，通過Nesprin蛋白與細胞骨架相連。SUN1/2蛋白通過這種結構形成LINC(linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)復合體，直接與細胞骨架和核骨架相連接，因此SUN1/2蛋白被認為在細胞核定位和遷移上具有非常重要的作用。
　　 研究表明，Sun1/2雙敲小鼠(Sun1-/-;Sun2-/-)在胚胎發(fā)

3、育早期死亡，提示SUN1/2蛋白可能在早期胚胎發(fā)育中起到極其重要的作用。雖然SUN1/2蛋白在核定位和遷移中的功能已經有所報道，但是其在胚胎早期發(fā)育特別是原腸運動中的作用還沒有相關研究。原腸運動是斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中三胚層形成的重要過程，其中集中延伸運動是其最主要的程序，它對于斑馬魚體軸的形成和延長起關鍵作用。在脊椎動物中，集中延伸運動主要受到平面細胞極性途徑（Wnt/Planar Cell Polarity pathway，Wnt

4、/PCP）的調節(jié)，它對于細胞的遷移以及胚胎發(fā)育過程中細胞的內卷內嵌等過程都起到顯著的調節(jié)作用。本課題通過在斑馬魚胚胎1-4細胞期注射嗎啉反義寡聚核苷酸（Morpholino，MO），特異性抑制SUN1和SUN2蛋白的表達，研究其在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的作用及相關機制。
　　 第一部分Sun1/2基因在斑馬魚早期胚胎中的表達
　　 為探討SUN1/2蛋白在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的功能，我們首先采用胚胎整封原位雜交和RT-PC

5、R的方法，檢測了Sun1/2基因在斑馬魚發(fā)育早期的時空表達情況。原位雜交結果顯示，Sun1和Sun2基因在胚胎8細胞期已經表達，為母源性表達，且在斑馬魚胚胎呈現(xiàn)泛表達;RT-PCR結果顯示，Sun1在斑馬魚胚胎30％下包期表達較高，而Sun2在胚胎30％下包至尾芽期均呈現(xiàn)高表達。以上結果提示，SUN1/2可能在斑馬魚早期胚胎發(fā)育原腸運動中起到重要作用。
　　 第二部分SUN1/2對斑馬魚早期胚胎發(fā)育集中延伸運動的影響
　　

6、 為研究SUN1/2蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用，我們采用胚胎早期顯微注射MO的方法，特異性抑制SUN1/2蛋白的表達，并觀察對于胚胎發(fā)育的影響。結果發(fā)現(xiàn)，單獨抑制SUN1或SUN2的表達，沒有對胚胎發(fā)育產生嚴重影響，而同時抑制SUN1/2的表達，胚胎表現(xiàn)出前后體軸縮短、尾部彎曲、體節(jié)部位變寬等表型，且呈現(xiàn)出一定程度的MO劑量依賴性。由此提示SUN1/2蛋白存在功能上的冗余，而同時抑制SUN1/2蛋白的表達對斑馬魚胚胎早期發(fā)育中的原腸

7、運動造成影響。為進一步確認抑制SUN1/2蛋白的表達是否對斑馬魚胚胎原腸運動中極其重要的集中延伸運動造成影響，我們采用胚胎整封原位雜交技術，檢測了集中延伸運動相關標記基因ntl、hgg1、dlx3b、tbx6、myod1、krox20等的表達變化。結果顯示，抑制SUN1/2蛋白表達后，胚胎集中延伸相關標記基因表達均出現(xiàn)明顯異?；虍愇唬砻饕种芐UN1/2表達后，胚胎發(fā)育中的軸向中胚層、軸旁中胚層、神經外胚層發(fā)育均出現(xiàn)缺陷，胚胎集中延伸運

8、動受到嚴重影響。由此可見，SUN1/2蛋白在斑馬魚胚胎早期發(fā)育的集中延伸運動過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 第三部分SUN1/2對斑馬魚集中延伸運動調節(jié)機制的研究
　　 哺乳動物中的研究證實，SUN1/2蛋白對于核孔復合體在核膜上正常分布很重要，而脊椎動物原腸運動中的細胞遷移與β-catenin蛋白在細胞內的分布相關。為研究SUN1/2蛋白是否通過影響β-catenin蛋白的核轉運調節(jié)斑馬魚集中延伸運動，我們收集注射MO

9、的斑馬魚胚胎，分離核蛋白及胞漿蛋白，采用蛋白免疫印跡技術檢測β-catenin蛋白在細胞核及細胞漿中的分布變化。結果顯示，注射SUN1/2 MO并未影響β-catenin蛋白在細胞內的分布，提示抑制SUN1/2蛋白的表達并未影響核孔復合體的核轉運功能。此外，脊椎動物中，集中延伸運動主要受到Wnt/PCP信號通路的調節(jié)。為研究抑制SUN1/2表達后是否影響Wnt/PCP信號通路，我們采用蛋白免疫印跡技術，檢測了關鍵因子P-JNK蛋白表達情

10、況，結果發(fā)現(xiàn)抑制SUN1/2蛋白表達后，P-JNK表達明顯降低。為進一步驗證該結果，我們采用RT-PCR技術檢測了Wnt/PCP信號通路下游靶基因liv1和stat3的表達情況，結果顯示抑制SUN1/2表達后，liv1和stat3表達有所下調。這些結果表明，SUN1/2通過Wnt/PCP信號通路調節(jié)斑馬魚集中延伸運動，對于進一步深入的調節(jié)機制有待于繼續(xù)研究。
　　 總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，SUN1/2蛋白通過Wnt/PCP信號