RP2敲除導(dǎo)致斑馬魚視網(wǎng)膜色素變性的機(jī)制研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一種進(jìn)行性的視網(wǎng)膜退化疾病，具有家族遺傳性，以感光細(xì)胞的功能喪失和逐漸凋亡為主要病因，在人群中的發(fā)病率為1/3000~1/7000。RP具有高度遺傳異質(zhì)性，目前已有超過100個(gè)RP致病基因被鑒定。RP患者的臨床癥狀也十分多樣，通常表現(xiàn)為夜盲（青少年時(shí)期）、管狀視野（中年時(shí)期）和失明（老年時(shí)期）。
　　Schwahn等于1998年首次通過定位克隆發(fā)現(xiàn)RP2是X連鎖隱性視網(wǎng)膜色素變性（XLRP）的致病基因。目前

2、已有70多個(gè)RP2突變被報(bào)道與RP相關(guān)，其突變?cè)赬LRP案例中的比例為7~18％。RP2位于X染色體p11.3區(qū)域，編碼一條廣泛表達(dá)的350 aa多肽。RP2蛋白含有TBCC和NDPK兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，在視網(wǎng)膜中定位于所有細(xì)胞的細(xì)胞膜。RP2在進(jìn)化過程中高度保守，斑馬魚的RP2蛋白與人具有67%的序列一致性。ARL3是RP2的主要相互作用蛋白。RP2可以促進(jìn)ARL3的GTP酶活性，使得ARL3與UNC119解離。RP2-ARL3-UNC119

3、三元復(fù)合體可能在豆蔻?；睦w毛蛋白的運(yùn)輸中發(fā)揮作用。RP2突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性的具體機(jī)制目前還不清楚。為了解答這一難題，本研究中，我們利用斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)RP2的生理功能進(jìn)行了一系列探索。
　　首先，我們通過TALEN技術(shù)成功獲得了RP2完全敲除的斑馬魚品系。ERG檢測顯示在6~7 dpf時(shí)RP2敲除斑馬魚的b波振幅與WT相比下調(diào)了約25%，表現(xiàn)出輕度的視力缺損。視網(wǎng)膜組織學(xué)分析和免疫熒光分析表明，在2個(gè)月的RP2敲除斑馬魚

4、中，視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)異常（視桿細(xì)胞外節(jié)出現(xiàn)色素沉積，視錐細(xì)胞核及外節(jié)排列紊亂），正處于感光細(xì)胞變性的早期階段。在4個(gè)月時(shí)視桿細(xì)胞的外節(jié)已顯著變短，其細(xì)胞核及胞體所組成的核層也明顯變薄，代表視桿細(xì)胞的死亡已累積到比較多的程度。TUNEL分析證實(shí)RP2敲除斑馬魚存在感光細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果證實(shí)在斑馬魚中RP2突變確可導(dǎo)致進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性。此外，RP2敲除斑馬魚并未表現(xiàn)出明顯的形體缺陷，視網(wǎng)膜分層也正常，表明RP2對(duì)斑馬魚的生存

5、和視網(wǎng)膜的發(fā)育不是必需的。
　　其次，在探索RP2在斑馬魚體內(nèi)的生理功能方面，我們也取得了一些進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn) RP2敲除可導(dǎo)致光轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中豆蔻?；鞍?GNAT1的蛋白水平下調(diào)，部分證實(shí)了 RP2-ARL3-UNC119三元復(fù)合體可能在斑馬魚體內(nèi)參與運(yùn)輸和維持豆蔻?；揎椀囊暰W(wǎng)膜蛋白。此外，在RP2敲除斑馬魚中，光轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的另一蛋白 GRK1在視網(wǎng)膜中的蛋白水平也明顯下降了。GNAT1和GRK1突變?cè)谌酥锌梢詫?dǎo)致常染色體隱性的先

6、天性靜止性夜盲。GNAT1和GRK1的蛋白下調(diào)可以部分解釋RP2敲除斑馬魚的表型。
　　第三，GRK1是一個(gè)異戊二烯化修飾的蛋白，由此我們猜想 RP2敲除是否會(huì)影響視網(wǎng)膜中所有異戊二烯化蛋白的定位。利用anti-farnesyl抗體在RP2敲除斑馬魚視網(wǎng)膜中進(jìn)行免疫熒光分析證實(shí)了上述推測。我們發(fā)現(xiàn)RP2敲除后在視網(wǎng)膜外叢狀層中出現(xiàn)了異戊二烯化蛋白的異常累積，將RP2的功能與PDE6D（結(jié)合并穩(wěn)定異戊二烯化蛋白）聯(lián)系了起來，同時(shí)也表

7、明異戊二烯化修飾蛋白在視網(wǎng)膜功能維持中可能起著重要作用。
　　此外，我們還發(fā)現(xiàn)在成年斑馬魚眼睛中，RP2突變可導(dǎo)致α-tubulin電泳遷移率變慢，暗示RP2可能與tubulin的某種未知修飾有關(guān)。在這方面的深入研究有可能使我們發(fā)現(xiàn)RP2新的生理功能。
　　綜上所述，我們成功地構(gòu)建了RP2缺陷的斑馬魚模型，并在此模型中觀察到了進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性的表型。我們首次發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚體內(nèi)RP2敲除可導(dǎo)致光轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)蛋白GNAT1和GR