視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜多巴能無長突細胞調(diào)節(jié)Melanopsin表達的機制研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組遺傳性、致盲性眼病，屬于光感受器細胞及色素上皮(RPE)營養(yǎng)不良性退行性病變。病變部位首先發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮層(RPE)，由于RPE失去吞噬視細胞外節(jié)脫落盤膜和代謝產(chǎn)物的能力，引起視網(wǎng)膜感光細胞進行性損傷，最終導致患者失明。其發(fā)病機制目前尚未完全明了。然而，在視網(wǎng)膜變性晚期視力丟失的患者，若其眼球保留則仍可感知晝夜節(jié)律的變化，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜存在第三類感光細胞，即表

2、達視黑素的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Melanopsin-expressing retinal ganglion cells，mRGCs)或稱自主感光神經(jīng)節(jié)細胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCS)。
　　 150年來傳統(tǒng)上認為哺乳動物視網(wǎng)膜光感受器僅僅為視錐視桿細胞，mRGCs和它所表達的光敏感色素視黑素(Melanopsin)的發(fā)現(xiàn)，開辟了視覺領(lǐng)域里一

3、種嶄新的、令人興奮的研究方向。Melanopsin屬于G蛋白藕聯(lián)受體超家族，由氨基酸組成的單肽鏈均有七螺旋跨膜結(jié)構(gòu)，在第七螺旋處第336位點有一賴氨酸分子與視黃醛分子連接。光刺激使Melanopsin的視黃醛分子構(gòu)象變化，啟動光信號傳遞。在不感光的HEK-293細胞中表達Melanopsin發(fā)現(xiàn)其光敏感峰值在480nm左右，即對藍光較敏感。雖然Melanopsin不具有較高的光敏感性和空間分辨率，但mRGCs不僅可以接受視錐視桿的輸入信

4、息，還可以接受內(nèi)部視網(wǎng)膜的信息輸入，重要的是mRGCs可以接受來自多巴能無長突細胞(DA ACs)的信息傳遞，具有通過視網(wǎng)膜下丘腦束(RHT)傳導通路直接與大腦視交叉上核(SCN)等溝通的獨特能力。因此，在視網(wǎng)膜變性晚期感光細胞功能喪失之后如何維持或提高mRGCs的功能變得尤為重要。據(jù)報道Melanopsin在急性和慢性視網(wǎng)膜變性過程中表達降低，但導致其表達降低的相關(guān)分子機制并不清楚。
　　 微小RNA在發(fā)育過程中具有重要作用，

5、研究顯示：microRNA參與一系列重要的細胞過程，從細胞增殖、細胞凋亡、惡性轉(zhuǎn)化、到神經(jīng)元發(fā)育。因此，本研究假設(shè)：RCS大鼠視網(wǎng)膜變性早期，DA ACs中miR-133b過表達并下調(diào)重要轉(zhuǎn)錄因子pitx3的表達，降低TH和D2受體的表達，抑制DA ACs的發(fā)育、成熟和功能，致使DA ACs受損。受損的DA ACs合成與釋放DA的能力明顯降低，且與mRGCs間無法形成正常、有效的突觸聯(lián)系，最終導致Melanopsin的表達降低。

6、　　 本研究采用經(jīng)典的視網(wǎng)膜色素變性動物模型RCS大鼠(皇家外科學院大鼠Royalcollege of surgeon rat)為動物模型，從microRNA水平探討調(diào)節(jié)Melanopsin表達的分子機制。主要研究內(nèi)容包括采用Western blot及qRT-PCR檢測Melanopsin在視網(wǎng)膜變性過程中的表達變化；采用免疫組織化學染色、qRT-PCR、玻璃體腔注射D2受體激動劑研究多巴能無長突細胞DA ACs及mRGCs的形態(tài)學特

7、點和功能；采用microRNAqRT-PCR、原位雜交及免疫組織化學染色檢測miR-133b在視網(wǎng)膜變性過程中的表達情況、定位及檢測siRNA干擾miR-133b后Melanopsin變化情況。
　　 本課題在以下方面得到如下結(jié)果和結(jié)論：
　　 第一部分Melanopsin的表達水平在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中進行性降低
　　 研究發(fā)現(xiàn)與對照鼠相比視網(wǎng)膜變性過程中RGCs數(shù)目顯著降低，而mRGCs的分布及數(shù)目在生

8、后發(fā)育的整個過程中，甚至在視網(wǎng)膜變性晚期mRGCs數(shù)量沒有顯著改變。那么在視網(wǎng)膜變性過程中Melanopsin的表達分子水平如何？結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.Melanopsin表達無論是蛋白水平還是mRNA水平均降低。在變性早期p15時Melanopsin蛋白表達無明顯變化，而Melanopsin mRNA表達水平高于對照鼠，考慮可能是由于RCS大鼠出生2周后睜眼接受光刺激而發(fā)生的生理性Melanopsin mRNA表達升高。P30時Melanop

9、sin蛋白及mRNA表達與對照鼠相比均下降，變性中晚期p60、p90顯著下降，甚至不易檢測。2.Melanopsin與含有垂體腺苷酸環(huán)化酶(PACAP)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分布一致，表明Melanopsin存在于視網(wǎng)膜一下丘腦束含有PACAP的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)，PACAP的mRNA表達水平可間接反映mRGCs的數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)PACAP mRNA表達水平在變性早期p15、p30略高于對照組，在中晚期p60、p90時無明顯變化；而RGCs標

10、志物Thy1.1的mRNA表達水平在RCS大鼠視網(wǎng)膜中隨著病變的進展降低，即在p15 Thy1.1表達升高，p30、p60、p90均表達降低。此結(jié)果與本實驗室前期mRGCs及RGCs計數(shù)研究結(jié)果一致。以上結(jié)果提示在視網(wǎng)膜變性過程中Melanopsin的表達減少并不是由于mRGCs數(shù)目的降低，或許是由于調(diào)節(jié)Melanopsin表達的信號傳導通路障礙所致。
　　 第二部分多巴能無長突細胞(DA ACs)分泌的多巴胺(DA)是調(diào)控Me

11、lanopsin表達的重要因素
　　 其它學者研究發(fā)現(xiàn)，DA是視網(wǎng)膜中主要神經(jīng)活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)MelanopsinmRNA表達的能力，DA可能是通過mRGCs上的多巴胺受體Ⅱ(D2受體)發(fā)揮作用。DA主要由無長突細胞分泌，在視網(wǎng)膜信息處理過程中起重要的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)作用，而酪氨酸在胞質(zhì)內(nèi)被酪氨酸羥化酶(TH)催化形成DA，TH是DA合成的限速酶，即TH是DA合成的重要調(diào)節(jié)因素。TH主要分布在視網(wǎng)膜多巴能無長突神經(jīng)元，即DA

12、 ACs或A18中，因此，TH是DA ACs的可靠標志物。DA受體主要分為D1、D2兩大類受體，D1受體激活腺苷酸環(huán)化酶、D2抑制腺苷酸環(huán)化酶。D2受體又分為軸突后受體和自身受體。視網(wǎng)膜光感受器和色素上皮的D2突觸后受體和D2自身受體均可以反饋性調(diào)節(jié)多巴能神經(jīng)元的多巴胺合成與釋放。研究證明DA ACs和mRGCs樹突共定位在視網(wǎng)膜IPL的Sl亞層，DA ACs可指導RGCs樹突分層，并為mRGCs選擇性突觸聯(lián)系提供特異性指令。那么視網(wǎng)膜

13、變性中Melanopsin的表達減少是否是由于TH、D2受體的表達降低或DA的合成、釋放減少所致？視網(wǎng)膜變性過程中DA能神經(jīng)元與mRGCs發(fā)生怎樣的變化？
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.利用無長突細胞標記物calretinin行免疫熒光染色后，發(fā)現(xiàn)RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)網(wǎng)狀層(IPL)分層紊亂，特別是S1亞層結(jié)構(gòu)模糊不清。而DA ACs位于INL的最內(nèi)層，它的樹突主要定位于IPL的S1亞層，表明DA ACs的軸突樣結(jié)構(gòu)在視網(wǎng)膜變性過程中受到損

14、害。另一方面，利用mRGCs的標記物Melanopsin行免疫熒光染色，結(jié)果顯示mRGCs的樹突在IPL的結(jié)構(gòu)紊亂、陽性信號明顯減弱，甚至在IPL和INL無法追蹤，表明視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs也受到損傷，導致mRGCs與DAACs無法形成正常、有效的突觸聯(lián)系。2.TH及D2受體的mRNA表達水平在視網(wǎng)膜變性過程中顯著下降，D2的免疫熒光染色結(jié)果提示D2受體主要表達在INL最內(nèi)層的DA ACs膜上和神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)的神經(jīng)節(jié)細胞同時

15、也表達在外網(wǎng)層(OPL)和IPL網(wǎng)間細胞的軸突上。但是D2受體的表達在上述各部位的表達均有減少。3.在玻璃體腔給予D2受體激動劑R(-)-propylnorapomorphine hydrochloride(NPA)激活D2受體通路后發(fā)現(xiàn)Melanopsin表達水平得以恢復甚至提高。以上研究結(jié)果提示：視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs表達Melanopsin的能力沒有喪失，Melanopsin的表達降低可能與DA ACs功能損害有關(guān)。
　

16、　 第三部分過表達的MicroRNA133b及下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，pitx3，控制Melanopsin的表達
　　 微小RNA在發(fā)育過程中具有重要作用。它參與一系列重要的細胞過程，從細胞增殖、細胞凋亡、惡性轉(zhuǎn)化、到神經(jīng)元發(fā)育等。其它學者發(fā)現(xiàn)在中腦的多巴能神經(jīng)元中，miR-133b與pitx3形成的負反饋調(diào)節(jié)多巴能神經(jīng)元的發(fā)育、成熟與功能，那么是否視網(wǎng)膜中miR-133b與pitx3間也形成了同樣的負反饋調(diào)節(jié)？是否miR-133b在

17、視網(wǎng)膜變性過程中呈現(xiàn)過表達狀態(tài)從而導致了DA ACs的功能衰竭？那么如何挽救DAACs功能，從而恢復Melanopsin的表達？
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：microRNA，miR-133b特異性地表達在視網(wǎng)膜DA ACs中，并且在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性早期階段(p15)顯著表達增高，同時，miR-133b與pitx3共定位于DAACs中。過度表達的miR-133b下調(diào)了重要轉(zhuǎn)錄因子pitx3的表達。表明：在視網(wǎng)膜中miR-133b與pit

18、x3同樣形成了負反饋調(diào)節(jié)。由于DAACs中miR-133b過表達下調(diào)pitx3的表達水平，從而抑制了DA ACs的發(fā)育、成熟和功能。Pitx3低表達降低了TH和D2受體的表達以及多巴胺產(chǎn)生。一方面受損的DA ACs與mRGCs之間不能形成有效的突觸聯(lián)系；另一方面由于DA的減少最終導致Melanopsin的表達降低。應(yīng)用siRNA干擾miR-133b后，DAACs中pitx3和TH表達上調(diào)，恢復了DA的合成與釋放，從而使Melanopsi

19、n表達水平得以恢復。
　　 綜上所述，本課題得出如下結(jié)論：
　　 1、在microRNA水平上闡明了Melanopsin表達的調(diào)控機制。Melanopsin表達減少原因并不是mRGCs數(shù)目減少所致，而是由于miR-133b過表達和pitx3的表達下降導致DA ACs在視網(wǎng)膜變性過程中功能受損，明顯削弱了DA/D2的相互作用，引起Melanopsin表達減少。
　　 2、RCS大鼠視網(wǎng)膜中TH和D2 mRNA及蛋白

20、表達降低是mRGCs中Melanopsin表達減少的主要原因，表明DA是調(diào)控非視覺成像系統(tǒng)的重要因素。此外，由于視覺成像系統(tǒng)的光感受器表面也表達大量多巴胺受體家族分子，因此，DA是調(diào)控視覺成像與非成像系統(tǒng)的重要分子。間接地反映了非視覺成像系統(tǒng)與視覺成像系統(tǒng)之間存在直接的聯(lián)系。
　　 3、siRNA/miR-133b上調(diào)TH、D2以及Melanopsin，證明視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs表達Melanopsin功能并未受損，并且通過