視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性性疾病的相關(guān)研究.pdf

1、本研究將通過(guò)三部分,來(lái)介紹人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(human retinal progenitor cell, hRPC)移植入視網(wǎng)膜變性小鼠的相關(guān)研究。第一部分:人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的體外培養(yǎng);第二部分:對(duì)于 rhodopsin-/-小鼠視網(wǎng)膜變性過(guò)程的動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察;第三部分: rhodopsin-/-小鼠視網(wǎng)膜下 hRPC移植后的視網(wǎng)膜形態(tài)和功能變化的動(dòng)態(tài)觀察。
　　第一部分:人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的低氧培養(yǎng)
　　目的:比較人類視網(wǎng)膜祖

2、細(xì)胞(hRPC)在常氧濃度培養(yǎng)(20％氧濃度)和低氧濃度培養(yǎng)(3％氧濃度)下各方面性狀的差異,如細(xì)胞的自我更新、增殖及細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的能力等。初步研究相關(guān)的細(xì)胞因子及信號(hào)通路,了解相關(guān)現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制。
　　方法:從人類胎兒視網(wǎng)膜中分離得到視網(wǎng)膜祖細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)條件分為常氧培養(yǎng)(20％氧濃度)和低氧培養(yǎng)(3％氧濃度),觀察細(xì)胞在兩種培養(yǎng)條件下生物學(xué)特性的差異,并在特定時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平檢

3、測(cè)(蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè))和基因 mRNA水平檢測(cè)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),通過(guò)這些檢測(cè)的結(jié)果推斷各細(xì)胞因子(低氧誘導(dǎo)因子)在低氧培養(yǎng)中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:hRPC在低氧培養(yǎng)(3％氧濃度)條件下細(xì)胞增殖曲線及MTT實(shí)驗(yàn)均提示較好的細(xì)胞增殖水平,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和細(xì)胞免疫化學(xué)染色也分別從相關(guān)基因 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平方面說(shuō)明了細(xì)胞增殖水平的增強(qiáng),如Ki67、Cyclin D1。而且低氧培養(yǎng)條件下的hRPC維持了

4、向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的能力,Klf4、c-Myc在基因和蛋白水平表達(dá)均高于常氧培養(yǎng)條件。低氧誘導(dǎo)因子1a(Hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)在低氧培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)高于常氧培養(yǎng),且表達(dá)水平隨時(shí)間而變化。
　　結(jié)論:本研究證明低氧濃度培養(yǎng)環(huán)境有利于人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增,并能夠維持細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的能力。低氧誘導(dǎo)因子1a可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。低氧培養(yǎng)模式可以為視網(wǎng)膜變性性疾病的研究和今后可能的

5、細(xì)胞移植治療提供大量未分化狀態(tài)的人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。
　　第二部分: Rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜變性過(guò)程的在體動(dòng)態(tài)觀察
　　目的:視網(wǎng)膜色素變性(RP)和老年性黃斑變性(AMD)是兩類主要的造成不可逆性失明的視網(wǎng)膜變性性疾病。嚙齒類動(dòng)物模型是我們理解這類疾病的重要工具。之前的研究已經(jīng)表明視網(wǎng)膜紫質(zhì)是視網(wǎng)膜光傳導(dǎo)過(guò)程中必不可少的要素,同時(shí)也是視桿細(xì)胞外節(jié)重要的結(jié)構(gòu)蛋白。Rhodopsin-/-鼠不表達(dá)視網(wǎng)膜紫質(zhì),不形成視桿

6、細(xì)胞外節(jié),在出生后短短的幾個(gè)月內(nèi)視桿細(xì)胞便會(huì)消失,繼之是視錐細(xì)胞功能和數(shù)量的喪失。本部分研究采用頻域光學(xué)相干斷層掃描(Spectral Domain Optical Coherence Tomography, SD-OCT)動(dòng)態(tài)連續(xù)性觀察 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜形態(tài)方面的變化。
　　方法:選擇出生后第3、6、9和12周的rhodopsin-/-鼠(C57Bl6 rhodopsin基因敲除)和野生型 C57Bl6鼠用于本研

7、究。SD-OCT采用放射狀體積掃描模式(以視盤為中心,直徑1.3mm的掃描范圍)。每個(gè)體積掃描包含100個(gè)B掃描(每個(gè)B掃描包含1000個(gè)A掃描)。選取特定的掃描進(jìn)行視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer, ONL)厚度的測(cè)量。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行視網(wǎng)膜組織學(xué)檢查,并將得到的數(shù)據(jù)和SD-OCT所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。記錄暗適應(yīng)和明適應(yīng)條件下的視網(wǎng)膜電圖(Electroretinograms,ERG),對(duì)視網(wǎng)膜功能學(xué)變化和形態(tài)學(xué)

8、變化進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:SD-OCT測(cè)量數(shù)據(jù)顯示 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜外核層厚度在其出生后第3周至第12周逐漸變薄。第3、6、9和12周的厚度值分別為40.6±1.61μm,27.9±1.65μm,14.5±0.7μm和6.0±0.78μm。在 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜無(wú)法觀察到視桿細(xì)胞外節(jié)。視網(wǎng)膜組織學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示出同 OCT檢測(cè)相同的趨勢(shì)。在第3周時(shí), rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜外核層有9-1

9、0層細(xì)胞核,而C57Bl6鼠有11-12層細(xì)胞核;到第12周時(shí),rhodopsin-/-鼠外核層細(xì)胞核層數(shù)已經(jīng)減低到1-2層,而野生型小鼠細(xì)胞核層數(shù)穩(wěn)定在11-12層。Rhodopsin-/-鼠的明適應(yīng)和暗適應(yīng)條件下的ERG均不能見(jiàn)到明顯 a波,而b波波幅也隨年齡增長(zhǎng)而降低,同形態(tài)學(xué)觀察到的結(jié)果一致。而野生型 C57Bl6鼠在各時(shí)間點(diǎn)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的測(cè)量值基本穩(wěn)定。
　　結(jié)論:通過(guò) SD-OCT測(cè)量得到的數(shù)據(jù)確認(rèn)了rhodopsi

10、n-/-鼠外核層厚度在其出生后逐漸變薄,而在野生型小鼠中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變化。并且視網(wǎng)膜組織學(xué)檢測(cè)和ERG功能學(xué)的定量檢測(cè)都證實(shí)了OCT所得到的結(jié)果。因此,SD-OCT可以作為一種無(wú)創(chuàng)性的、有效并且可靠的研究工具,用于動(dòng)態(tài)觀察視網(wǎng)膜變性性疾病動(dòng)物模型的疾病變化過(guò)程。
　　第三部分:Rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜下視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的移植
　　目的:將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞通過(guò)手術(shù)方式注入藥物(環(huán)孢素)免疫抑制的rhodopsin

11、-/-鼠視網(wǎng)膜下,觀察細(xì)胞移植后的存活、移行、和受體視網(wǎng)膜結(jié)合及分化等情況,評(píng)估移植后視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜形態(tài)(組織學(xué)檢測(cè)和SD-OCT檢測(cè))和功能(ERG)的相關(guān)變化。
　　方法:移植細(xì)胞為體外低氧濃度(3％)培養(yǎng)的hRPC(細(xì)胞代數(shù)為第7至第9代)。移植受體鼠rhodopsin-/-鼠經(jīng)過(guò)環(huán)孢素免疫抑制。通過(guò)手術(shù)方式,將 hRPC(對(duì)照組注入 PBS)注射入小鼠視網(wǎng)膜下。于術(shù)后第3天和第3周對(duì)術(shù)眼進(jìn)行 OCT觀察,并于第3周

12、 OCT觀察結(jié)束后進(jìn)行 ERG檢測(cè),隨后處死小鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜組織學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果:在移植之后的第3天和第3周分別進(jìn)行 OCT觀察,均可在移植成功的小鼠視網(wǎng)膜下見(jiàn)到移植細(xì)胞存在,并能夠通過(guò)隨后的組織學(xué)檢查證實(shí)。對(duì)組織學(xué)切片進(jìn)行相關(guān)免疫染色后可以觀察到 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜下存活的移植細(xì)胞,但是在移植后第3周也幾乎觀察不到 hRPC向受體鼠視網(wǎng)膜的移行和整合。在對(duì)移植細(xì)胞小鼠和對(duì)照小鼠(僅在視網(wǎng)膜下注入 PBS)的視網(wǎng)膜功

13、能學(xué)檢查(ERG)中未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論:通過(guò)環(huán)孢素對(duì)細(xì)胞移植受體鼠進(jìn)行免疫抑制,可以提高移植細(xì)胞的存活率。移植后細(xì)胞并未向受體視網(wǎng)膜移行和整合,視網(wǎng)膜功能檢測(cè)未見(jiàn)改善。
　　研究總結(jié)：
　　一、主要研究結(jié)果
　　1.人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在低氧濃度培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出較好的增殖趨勢(shì),增殖相關(guān)因子 Ki67、Cyclin D1在基因和蛋白水平的表達(dá)也高于常氧培養(yǎng);而低氧條件下干細(xì)胞特性相關(guān)因子 c-Myc、Klf4也同

14、樣有較高的基因和蛋白表達(dá)水平。低氧誘導(dǎo)因子1a在低氧培養(yǎng)的細(xì)胞中有表達(dá),而在常氧培養(yǎng)細(xì)胞中僅有低量表達(dá)。
　　2.SD-OCT測(cè)量數(shù)據(jù)顯示 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜外核層厚度在其出生后第3周至第12周逐漸變薄。視網(wǎng)膜組織學(xué)檢測(cè)也顯示出相同的趨勢(shì)。Rhodopsin-/-鼠的ERG不能見(jiàn)到明顯 a波,而b波波幅也隨年齡增長(zhǎng)而降低,同形態(tài)學(xué)觀察到的結(jié)果一致。而野生型 C57Bl6鼠在各時(shí)間點(diǎn)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的測(cè)量值基本穩(wěn)定。

15、r>　　3.SD-OCT可在移植成功的小鼠視網(wǎng)膜下見(jiàn)到移植細(xì)胞存在,并能夠通過(guò)隨后的組織學(xué)檢查證實(shí)。組織學(xué)切片可以觀察到 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜下存活的移植細(xì)胞,但幾乎觀察不到細(xì)胞向受體鼠視網(wǎng)膜的移行和整合。在對(duì)移植細(xì)胞小鼠和對(duì)照小鼠(視網(wǎng)膜下注入 PBS)的視網(wǎng)膜功能學(xué)檢查(ERG)中未見(jiàn)明顯差異。
　　二、研究結(jié)論：
　　1.低氧濃度培養(yǎng)條件有利于人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增,并能夠維持細(xì)胞的分化能力。低氧培養(yǎng)條

16、件下,細(xì)胞所表現(xiàn)出來(lái)的性狀可能受到低氧誘導(dǎo)因子1a的調(diào)控。低氧濃度培養(yǎng)可作為人類視網(wǎng)膜祖細(xì)胞常規(guī)的培養(yǎng)方式。
　　2.通過(guò) SD-OCT測(cè)量得到的數(shù)據(jù)確認(rèn)了rhodopsin-/-鼠外核層厚度在其出生后逐漸變薄。并且視網(wǎng)膜組織學(xué)檢測(cè)和ERG功能學(xué)的定量檢測(cè)都證實(shí)了OCT所得到的結(jié)果。SD-OCT可以作為一種無(wú)創(chuàng)性的、有效并且可靠的研究工具,用于動(dòng)態(tài)觀察視網(wǎng)膜變性性疾病動(dòng)物模型的疾病變化過(guò)程。
　　3.通過(guò)環(huán)孢素對(duì) rhodo