雙突變視紫紅質(zhì)蛋白(Rho-R135G-G188R)轉(zhuǎn)基因斑馬魚視網(wǎng)膜色素變性模型的建立.pdf

1、目的：建立一種視紫紅質(zhì)雙突變-R135G/G188R暫時(shí)性(transient)轉(zhuǎn)基因斑馬魚視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)模型，并檢驗(yàn)該突變所致視網(wǎng)膜變性的特征。
　　 方法：將兩種經(jīng)基因工程改造的質(zhì)粒pXOP1.3-EGFP-rho和pXOP1.3-EGFP-rho-R135G/G188R通過顯微注射的方法導(dǎo)入野生型斑馬魚胚胎，制造出兩種暫時(shí)性轉(zhuǎn)基因斑馬魚(F0代)，分別表達(dá)外源性的野生型斑馬

2、魚視紫紅質(zhì)或其雙突變體(Rho-R135G/G188R)。用活體常規(guī)熒光顯微鏡觀察法篩選出增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)陽性的F0代轉(zhuǎn)基因幼魚。并用熒光和/或免疫熒光冰凍切片分析技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因視紫紅質(zhì)的水平和其在視網(wǎng)膜上的分布，以及視網(wǎng)膜變性的表現(xiàn)。
　　 結(jié)果：在本試驗(yàn)中，1.3-kb的爪蟾視紫紅質(zhì)啟動子(Xenopus thodopsin promoter，XOP)片段足以替代全長5.5-kb的XOP啟動轉(zhuǎn)基因構(gòu)造表達(dá)。通過

3、常規(guī)熒光顯微鏡下觀察完整活體斑馬魚幼魚眼睛熒光表達(dá)情況以及圖像采集，可鑒別出成功的轉(zhuǎn)基因個(gè)體:三次顯微注射試驗(yàn)總計(jì)約1000枚胚胎中，平均約5％-7％的幼魚呈EGFP陽性。冰凍切片分析顯示，魚卵受精后第5天(5 days post fertilization，5dpf)Rho-R135G/G188R表達(dá)水平即下降，相反，對照轉(zhuǎn)基因幼魚外源性視紫紅質(zhì)表達(dá)水平卻明顯升高；結(jié)合EGFP在視網(wǎng)膜上的分布位置分析，可能是轉(zhuǎn)入的雙突變視紫紅質(zhì)的表達(dá)

4、導(dǎo)致了視桿細(xì)胞特異性的視網(wǎng)膜變性，考慮到對照外源性轉(zhuǎn)基因視紫紅質(zhì)沒有引起此現(xiàn)象，提示視桿細(xì)胞死亡是呈R135G/G188R突變特異性的。
　　 結(jié)論：利用由細(xì)胞特異性啟動子加上帶有EGFP編碼序列標(biāo)簽的兩種RhoCDS片段組成的質(zhì)粒，可以成功制備出兩種暫時(shí)性轉(zhuǎn)基因斑馬魚RP模型；該模型證實(shí)1.3-kbXOP片段是一種跨物種性的足夠強(qiáng)的啟動子，也為II類視紫紅質(zhì)突變--R135G/G188R導(dǎo)致視紫紅質(zhì)蛋白折疊錯(cuò)誤進(jìn)而發(fā)生以視桿細(xì)