雙酚A對(duì)斑馬魚(yú)的生態(tài)毒性及致毒機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(endocrine disrupting chemicals，EDCs)已被證實(shí)對(duì)生態(tài)和人體健康有著不可忽視的影響，但對(duì)其致毒機(jī)理，特別是否有相應(yīng)的基因表達(dá)，目前仍在探索階段。本論文以環(huán)境中廣泛存在的雙酚A(BPA)為研究對(duì)象，以斑馬魚(yú)為模式種，應(yīng)用基因芯片分析技術(shù)，從斑馬魚(yú)RNA水平的影響入手，探索污染物造成的基因表達(dá)所導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)，建立基因誘變與個(gè)體有害效應(yīng)的關(guān)系，找出了一系列的標(biāo)志物和標(biāo)志基因，為環(huán)境中雙酚A的

2、監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)提供了可靠詳實(shí)的證據(jù)，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了合理的探討。實(shí)驗(yàn)主要分兩個(gè)部分的內(nèi)容：一高濃度雙酚A(5-25 mg/L)暴露，雙酚A對(duì)斑馬魚(yú)造成的個(gè)體有害效應(yīng)，得到的結(jié)果如下：
　　 1.雙酚A會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)、仔魚(yú)和胚胎造成毒性。致死敏感性上表現(xiàn)為：成魚(yú)、仔魚(yú)>胚胎，斑馬魚(yú)胚胎表現(xiàn)為更顯著的亞致死毒性作用。胚胎亞致死敏感效應(yīng)表現(xiàn)為：卵凝結(jié)，孵化率降低>血流障礙>心包囊水腫>尾畸和脊椎彎曲。同時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎在Ohpf(O h

3、our post fertilization)暴露下對(duì)BPA的富集量比8hpf(8 hour post fertilization)暴露條件下更大，同時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的致死和亞致死毒性都高，證明斑馬魚(yú)胚胎在發(fā)育早期階段對(duì)BPA污染更為敏感。8h終止試驗(yàn)(Ohpf染毒8h后將胚胎換到營(yíng)養(yǎng)水中繼續(xù)培養(yǎng)觀察)進(jìn)一步證明原腸胚期前的斑馬魚(yú)胚胎對(duì)BPA的毒性更為敏感。
　　 2.HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)PA暴露濃度和時(shí)間的增大，胚胎體內(nèi)BPA含

4、量在不斷的增大，直至胚胎死亡。5.00 mg/L BPA的48 h連續(xù)暴露下，胚胎和成魚(yú)體內(nèi)含量分別為373.57±39.76pg/g和155.78±17.97μg/g，相同暴露濃度下胚胎的蓄積能力大約是成魚(yú)的兩倍。
　　 3.環(huán)境中BPA不是單一存在的。BPA和五氯酚對(duì)胚胎聯(lián)合毒性試驗(yàn)中，24h死亡和32 h血流障礙表現(xiàn)為協(xié)同作用，72 h心包囊水腫表現(xiàn)為拮抗作用。二將斑馬魚(yú)胚胎從受精后1-2 h開(kāi)始在BPA中暴露8天，選擇的

5、BPA濃度在EPA規(guī)定的引用水中BPA的安全濃度(1.5 mg/L)范圍左右，利用組織切片、基因芯片、Real-time PCR和代謝組學(xué)技術(shù)找出BPA作用的生物標(biāo)志物，并對(duì)該“安全濃度”進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到以下結(jié)論：
　　 1.組織切片試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.5和4.5 mg/L BPA暴露8天，斑馬魚(yú)仔魚(yú)的頭部和腦部的尺寸顯著減??；心室也明顯增大；肝細(xì)胞核仁破碎，沒(méi)有集合在球形細(xì)胞核的中心；肝臟中血細(xì)胞增多，正常肝細(xì)胞核減少。
　　

6、 2.代謝組學(xué)中，PCA圖分析可得，空白對(duì)照組與BPA暴露組(0.5、1.5和4.5mg/L)成不同的簇狀分布，證明8天的BPA暴露能顯著導(dǎo)致斑馬魚(yú)的代謝組分變化。從個(gè)體代謝組分上看、低濃度BPA暴露能使斑馬魚(yú)體內(nèi)的有益不飽和脂肪酸、氨基酸、磷酸、葡萄糖和谷甾醇的百分含量降低，肌糖的百分率升高。
　　 3.基因芯片找出了主要六個(gè)功能方面的50個(gè)標(biāo)志基因，包括：(1)信號(hào)傳導(dǎo)，如ZGC100933、ZGC85725、APOEB等；

7、(2)離子結(jié)合，如ZGC77495、EGR2A、SP4等：(3)核酸物質(zhì)加合，ZGC55521、A2BPA1、SEPTIN2等(4)：器官發(fā)育，如BDNF、PAK2B、CLDN1等；(5)代謝轉(zhuǎn)化，如FABP7A、CTHL、CSRP2BP等；(6)BPA特有的氧化性特性，如BCKDHA、HSD1784和TBXAS1，以及內(nèi)分泌干擾特性，如CALCA和CYP2X12。同時(shí)，基因芯片能夠?qū)Χ拘员┞丁⒔M織切片形態(tài)觀察和代謝組學(xué)所得到的結(jié)果作出

8、合理解釋。
　　 4.Real-time PCR發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比內(nèi)分泌干擾標(biāo)志基因AHR1、ESR1、VTG1、VTG3和CYP1A1在低劑量BPA暴露中都上調(diào)，證明了BPA的內(nèi)分泌干擾特性。
　　 5.1.5 mg/L對(duì)于斑馬魚(yú)仔魚(yú)是不安全的。甚至在50μg/L BPA暴露下，仍然有7個(gè)標(biāo)志基因表現(xiàn)為上調(diào)，這些基因會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的離子結(jié)合、代謝、遺傳和信號(hào)傳遞造成影響。
　　 本試驗(yàn)以斑馬魚(yú)為生物模式，綜合