同源重組功能缺陷對H2AX磷酸化型微核發(fā)生的影響.pdf

1、DNA損傷種類多，發(fā)生頻率高，是細胞生存、分裂和執(zhí)行正常功能的主要威脅之一。DNA損傷既可以由內(nèi)源性的活性氧和DNA復制錯誤等導致，也可由各種環(huán)境因素產(chǎn)生。有機體在漫長的進化過程中，獲得了多種不同類型的修復方式，用于多樣的DNA損傷。其中，作為最嚴重的損傷形式之一，DNA雙鏈斷裂可由同源重組(Homologous recombination repair，HRR)和非同源末端連接(Non-homologous end joining，N

2、HEJ)兩條通路修復。同源重組(HRR)又被稱為基本重組(general recombination)，是指在同源序列之間發(fā)生的重組，它不需要特意的DNA序列，而是在兩個DNA分子的同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的互換。在同源重組過程中的不同階段，每一步又需要不同的蛋白參與，比如早期的BRCA1和CtIP，中期的RPA1和RAD51，后期的TOP1、MUS81等。
　　微核是指獨立于細胞漿中，游離于細胞主核之外的體積微小的核。目前研

3、究普遍認為微核的形成原因主要是因為染色體由于損傷而發(fā)生斷裂，或者因紡錘絲出現(xiàn)故障而無法有效牽引染色體，導致在有絲分裂后期，細胞進入下一次有絲分裂時，染色體片段或整條染色體不能隨有絲分裂進入子細胞，從而使它們從細胞主核中脫離而形成微核。微核常被用于說明遺傳物質(zhì)損傷的程度，是衡量基因組不穩(wěn)定性和遺傳毒理學的重要指標之一。Terradas等研究者及本實驗室的前期研究中均發(fā)現(xiàn)了一種新型微核，此類微核因呈現(xiàn)出均勻彌散的H2AX磷酸化，因而將其稱之

4、為MN-γ-H2AX(+)。該類微核在總微核中的比例大約為1/5到1/3。我們實驗室早期發(fā)現(xiàn)，當使用導致ROS（活性氧）上調(diào)的H2O2處理細胞后，可檢測到微核尤其是MN-γ-H2AX(+)頻率的顯著上調(diào)，而抗氧化劑NAC的加入又能夠在一定程度上拯救由于H2O2加入所導致的微核頻率的增加，即ROS能夠誘導MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生。而當使用羥基脲(hydroxyurea，HU)，阿非迪霉素(aphidicolin，APH)等造成復制壓

5、力的藥物處理細胞24小時后，MN-γ-H2AX(+)頻率可升高2到3倍，而其他類型微核頻率升高幅度相對較低;干擾DNA復制蛋白RPA1后，MN-γ-H2AX(+)頻率也呈現(xiàn)顯著增加，即這類微核能夠被復制壓力特異性誘導。此外，通過分析MN-γ-H2AX(+)形成與遭遇復制壓力細胞的時間關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)MN-γ-H2AX(+)主要在S期產(chǎn)生。又因為上述藥物處理主要導致DNA復制叉的塌垮（collapsed replication forks），而

6、復制叉的塌垮主要由同源重組進行修復，那么是否同源重組功能缺陷不能有效修復塌垮復制叉從而導致MN-γ-H2AX(+)的增加？MN-γ-H2AX(+)是否能反應同源重組修復的能力呢？
　　基于以上問題，我們通過干擾同源重組不同階段成員的功能使同源重組通路產(chǎn)生缺陷，繼而發(fā)現(xiàn)同源重組功能缺陷可有效誘導微核頻率的增加;但不同階段成員的功能缺陷所造成的同源重組功能障礙誘導微核發(fā)生的效能并不相同，尤其反映在MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率;此

7、外，我們還發(fā)現(xiàn)同源重組功能缺陷導致微核頻率的變化與ROS及細胞周期的改變均有一定的聯(lián)系。
　　目的：
　　本研究旨在進一步明確MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生機制;研究同源重組通路在降低微核發(fā)生并維持基因組穩(wěn)定性中的作用;評估MN-γ-H2AX(+)作為同源重組功能指標的可行性。
　　方法：
　　以U2OS細胞系為研究材料，干擾同源重組各階段的不同成員CtIP（早期階段）;RAD51（中期階段）和TOP1、MUS8

8、1（后期階段）的功能。探討MN-γ-H2AX(+)發(fā)生頻率與同源重組功能之間的關(guān)系。
　　1.通過siRNA干擾同源重組通路及非同源末端連接通路中不同成員的表達，利用Western blotting和Real-time PCR技術(shù)檢測干擾效率。
　　2.利用免疫熒光技術(shù)檢測主核和微核中DNA雙鏈斷裂損傷標記γ-H2AX的染色情況。
　　3.利用流式細胞術(shù)檢測干擾不同基因后ROS水平的變化。
　　4.利用流式細胞術(shù)

9、檢測干擾同源重組通路中不同基因后細胞周期的變化。
　　結(jié)果：
　　1.復制叉停滯對微核的發(fā)生沒有影響，而復制叉塌垮則會誘導微核尤其是MN-γ-H2AX(+)頻率的顯著增加。
　　2.同源重組上游階段CtIP功能缺陷不能特異性誘導MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生。
　　3.同源重組中游階段RAD51功能缺陷可特異性誘導MN-vH2AX(+)發(fā)生。
　　4.同源重組下游階段TOP1、MUS81功能缺陷可特異性誘導

10、MN-γ-H2AX(+)發(fā)生。
　　5.非同源末端連接過程中關(guān)鍵成員LIG4的功能缺陷對MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生影響較小。
　　6.同源重組功能缺陷誘導MN-γ-H2AX(+)增加部分是通過ROS介導。
　　7.同源重組功能缺陷誘導MN-γ-H2AX(+)增加與細胞周期的變化有一定關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論：
　　同源重組修復通路中不同成員的功能缺陷誘導微核發(fā)生的效能并不相同，中下游階段成員功能缺陷可有效誘導M