誘導(dǎo)cofilin脫磷酸化對體外肝細(xì)胞極性重建的影響.pdf

1、研究目的：分析誘導(dǎo)cofilin去磷酸化對肝細(xì)胞極性重建的影響及其機(jī)制。 研究方法： 1、對體外培養(yǎng)肝細(xì)胞cofilin去磷酸的調(diào)控：利用SSH1L轉(zhuǎn)染大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，調(diào)控cofilin的去磷酸化，RT-PCR、Western-blot法檢測cofilin和P-cofilin，轉(zhuǎn)染后SSH1L在大鼠肝細(xì)胞的表達(dá)，免疫熒光法檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。 2、通過基因重組技術(shù)構(gòu)建cofilin原核生物表達(dá)載體，陽性重組體轉(zhuǎn)

2、化BL21(DE3)菌株，獲得cofilin蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。 3、肝細(xì)胞增殖能力與功能的檢測：MTT法檢測肝細(xì)胞增殖能力，生化檢測儀檢測肝細(xì)胞功能指標(biāo)如ALT，ALB，LDH。 4、研究cofilin對肝細(xì)胞骨架及膽小管網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)：觀察體外培養(yǎng)肝細(xì)胞膽小管網(wǎng)絡(luò)的形成和維持時間，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架肌動蛋白微絲空間構(gòu)象，密度的改變及其與膽小管網(wǎng)絡(luò)變化的關(guān)系。進(jìn)一步觀察誘導(dǎo)cofilin去磷酸化對膽小管網(wǎng)絡(luò)、細(xì)

3、胞骨架的影響。 研究結(jié)果： 第一部分：陽離子脂質(zhì)體法成功將SSH1L質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率達(dá)到70％以上，轉(zhuǎn)染后可見實驗組SSH1LmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯高于對照組，實驗組P-cofilin蛋白表達(dá)水平明顯下降。 第二部分：成功構(gòu)建cofilin-pET32高效表達(dá)質(zhì)粒，獲得cofilin蛋白的大量表達(dá)。 第三部分：實驗組肝細(xì)胞增殖能力，ALT，ALB，LDH，生存時間，膽小管網(wǎng)絡(luò)的

4、形成和維持時間均優(yōu)于對照組。膽小管的形成過程起始于肝細(xì)胞的極性區(qū)域，逐漸延伸、融合形成膽小管網(wǎng)絡(luò)，微絲與微管共同參與體外培養(yǎng)肝細(xì)胞膽小管網(wǎng)絡(luò)的形成和維持。與對照組相比，實驗組膽小管網(wǎng)絡(luò)形成的更快，保持時間更長。 研究結(jié)論： 1、應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可獲得SSH1L在肝細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。 2、外源SSH1L轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cofilin的去磷酸化。 3、轉(zhuǎn)染SSH1L后改善了肝細(xì)胞的增殖

5、水平。 4、體外培養(yǎng)肝細(xì)胞膽小管的形成依賴于鄰近肝細(xì)胞膜的極性區(qū)域。 5、微絲和微管共同參與了膽小管網(wǎng)絡(luò)的形成和維持，其形態(tài)和分布與其功能相適應(yīng)。 6、cofilin去磷酸有利于體外培養(yǎng)肝細(xì)胞膽小管網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞功能的維持，并且通過細(xì)胞骨架成分發(fā)揮作用。 7、體外通過轉(zhuǎn)染SSH1L誘導(dǎo)cofilin的去磷酸化作用，并非由于SSH1L催化活性的增加而是由于SSH1L的過表達(dá)所致。SSH1L的過表達(dá)并未抑制SSH