流體剪切力及cofilin磷酸化對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架改建的研究.pdf

1、骨改建的過(guò)程中機(jī)械應(yīng)力起著重要的作用。在骨組織細(xì)胞感受的諸多力學(xué)信號(hào)中，流體剪切力是最主要的一種形式。在骨改建過(guò)程中，成骨細(xì)胞起著重要的作用。研究表明，流體剪切力刺激后，成骨細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架會(huì)發(fā)生改建。 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是一種位于細(xì)胞核及胞漿內(nèi)的纖維狀蛋白質(zhì)基質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)傳遞應(yīng)力信號(hào)的重要途徑。應(yīng)力刺激可以引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組成的張力絲的再分布，從而引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改建和細(xì)胞形態(tài)的改變。但是剪切力刺激成骨細(xì)胞后，肌

2、動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建的微觀機(jī)制目前尚不明了。 研究表明，cofilin(絲切蛋白)是存在于真核細(xì)胞胞漿內(nèi)的一種可以解聚肌動(dòng)蛋白纖維的蛋白。在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)改建過(guò)程中，cofilin起著重要的作用。體外研究表明，多種刺激可以通過(guò)cofilin的磷酸化變化，從而調(diào)控成骨細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建。另有研究表明，cofilin介導(dǎo)了流體剪切力刺激引起平滑肌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建。而對(duì)于成骨細(xì)胞，cofilin是

3、否同樣介導(dǎo)了剪切力刺激引起的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建，目前尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)成骨細(xì)胞施加流體剪切力作用，觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改建，并通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)cofilin的磷酸化水平變化，進(jìn)一步了解剪切力刺激引起的成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建的微觀機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)分為兩部分： 實(shí)驗(yàn)一：不同時(shí)間剪切力作用對(duì)成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建的影響 目的：研究成骨細(xì)胞受到不同時(shí)間流體剪切力作用后，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞

4、骨架的改建變化，為下一步研究肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建的微觀機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：原代培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞，堿性磷酸酶以及Von Kossa礦化結(jié)節(jié)染色對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定；選用μ-slide作為剪切力加載裝置，采用12 dyne/cm<'2>流體剪切力對(duì)成骨細(xì)胞作用不同時(shí)間后，用FITC-phalloidin對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改建變化。 結(jié)果：酶消化法與組織塊法

5、體外培養(yǎng)獲取了原代成骨細(xì)胞，堿性磷酸酶以及VonKossa礦化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性；剪切力作用后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin明顯較對(duì)照組增粗，隨時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin的染色逐漸增強(qiáng)、纖維增粗；45 min后隨剪切力作用時(shí)間的延長(zhǎng)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改建趨于緩慢。 結(jié)論：采用兩種酶分段消化法，獲得了活力較旺盛、純度較高的成骨細(xì)胞；12dyne/cm2剪切力作用下，15 min便可以使成骨細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生改建。45

6、min后隨剪切力作用時(shí)間的延長(zhǎng)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改建趨于緩慢。 實(shí)驗(yàn)二：cofilin在介導(dǎo)剪切力引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建中的作用研究 目的：研究cofilin在流體剪切力引起的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改建中的作用。 方法：設(shè)計(jì)制作平行平板流室加載裝置，在此基礎(chǔ)上，采用12 dyne/cm<'2>的剪切力作用成骨細(xì)胞后，Western blot技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cofilin以及磷酸化eofilin(phospho