自噬性磷酸化修飾PAK1-cofilin途徑介導apelin-13促肺腺癌細胞遷移.pdf

1、目的:
　　本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)apelin-13通過ERK1/2促進肺腺癌A549細胞自噬發(fā)生，然而自噬的作用并不明確，本課題組前期研究以及文獻報道表明自噬參與細胞遷移調(diào)控，因此本研究意在探討apelin/APJ對肺腺癌細胞遷移的影響以及apelin/APJ誘導的自噬是否參與apelin對細胞遷移調(diào)控，闡明apelin/APJ影響肺腺細胞遷移的自噬-PAK1-cofilin的胞內(nèi)機制，初步評估apelin/APJ系統(tǒng)在肺癌轉(zhuǎn)移中

2、的靶標作用，為肺癌轉(zhuǎn)移治療提供新的有效靶點。
　　方法:
　　1.細胞遷移檢測：Wound healing、Transwell
　　2.ELISA:檢測apelin分泌
　　3.Western blotting:檢測APJ、p-PAK-1、PAK-1、p-cofilin、cofilin、LC3等相關蛋白的表達
　　4.基因轉(zhuǎn)染：通過轉(zhuǎn)染，檢測相關基因高表達與低表達對細胞功能的影響
　　5.MTT:研究

3、阿霉素和雷佐生對A549細胞活力的影響
　　6.AO/EB染色:熒光染色觀測阿霉素、雷佐生對細胞凋亡影響
　　結果:
　　1. Apelin-13誘導肺腺癌細胞遷移
　　Transwell結果顯示apelin-13可以劑量依賴的促進肺腺癌A549細胞遷移，其中0.01μM的apelin-13即可明顯促進細胞遷移，而0.1μM的apelin-13作用最強。Wound healing證實0.1μM apelin-13

4、時間依賴的促進A549細胞遷移。Transwell和woundhealing進一步證實0.1μM apelin-13顯著誘導肺腺癌大細胞H460和人高遷移肺腺癌95-D細胞遷移。
　　2. Apelin-13通過APJ誘導肺腺癌細胞遷移
　　構建含 APJ的重組質(zhì)粒載體 pcMV-Tag2B-APLNR和 APJ的干擾 RNA miR-APLNR-494、miR-APLNR-1712、miR-APLNR-1572序列正確無突

5、變，熒光拍照結果提示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功且高效，western blotting結果顯示轉(zhuǎn)染空載體pcMT-Tag2B對A549細胞APJ表達無影響，而pcMV-Tag2B-APLNR轉(zhuǎn)染明顯增加APJ表達，miR-APLNR-494顯著抑制APJ的表達，miR-APLNR-1712、miR-APLNR-1572對APJ表達無明顯降低作用。Wound healing顯示，用或者不用apelin-13處理，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染pcMV-T

6、ag2B-APLNR促進A549細胞遷移而轉(zhuǎn)染miR-APLNR-494抑制A549細胞遷移，transwell結果證實通過miR-APNLR-494抑制A549細胞APJ表達可以顯著降低apelin-13引起的細胞遷移。
　　3. Apelin-13誘導PAK1-Cofilin磷酸化促進肺腺癌A549細胞遷移
　　應用String服務器對apelin與PAK1進行蛋白蛋白相互作用預測，發(fā)現(xiàn)apelin與PAK1可能存在相互

7、作用。PAK1抑制劑IPA-3處理能夠顯著抑制apelin-13誘導的A549細胞遷移。而免疫印跡表明apelin-13處理A549細胞，可時間依賴的誘導PAK1和cofilin磷酸化，IPA-3顯著抑制apelin-13誘導的PAK1和cofilin磷酸化，western blot還證實，apelin-13可以顯著誘導PAK1蛋白表達，但是對cofilin表達無影響。
　　4.自噬介導apelin-13促肺腺癌A549細胞遷移<

8、br>　　Apelin-13誘導A549細胞LC3總蛋白和LC3Ⅱ表達。自噬抑制劑3-MA能夠抑制apelin-13誘導的LC3Ⅱ生成。A549細胞轉(zhuǎn)染LC3重組質(zhì)粒后apelin-13孵育，熒光顯微鏡拍照結果表明apelin-13誘導LC3細胞膜定位。Transwell結果證實自噬抑制劑3-MA可以明顯抑制A549細胞遷移，并且抑制apelin-13誘導的遷移，自噬誘導劑雷帕霉素顯著促進A549細胞遷移，雷帕霉素與apelin合用對細

9、胞遷移促進作用最強。
　　5.自噬誘導PAK1-cofilin磷酸化介導apelin-13促肺腺癌A549細胞遷移
　　自噬抑制劑3-MA時間依賴的抑制A549細胞中PAK1磷酸化，并且3-MA抑制apelin誘導的PAK1磷酸化，而自噬抑制劑3-MA同樣時間依賴的抑制A549細胞中cofilin磷酸化，并且抑制apelin-13誘導的磷酸化。
　　6. Apelin-APJ為肺腺癌遷移治療的潛在有效靶標
　　M

10、TT分析計算阿霉素對A549細胞的IC50為1.332μM。不同濃度（0.2μM,0.4μM,0.6μM,0.8μM,1μM）的阿霉素處理A549細胞，AO/EB熒光染色結果提示低濃度阿霉素并不顯著誘導細胞凋亡。而wound healing結果提示1μM阿霉素可以明顯抑制A549細胞遷移，選用1μM阿霉素為實驗濃度。Transwell結果證明:阿霉素可以顯著抑制A549細胞遷移，而apelin-13能夠抵消阿霉素的抑制作用，轉(zhuǎn)染pcMV

11、-Tag2B-APLNR的細胞，阿霉素的作用被逆轉(zhuǎn)，而在轉(zhuǎn)染miR-APLNR-494的細胞，即使用apelin-13處理，阿霉素也顯著抑制A549細胞遷移。MTT計算得出雷佐生的IC50為892.164μM，wound healing顯示10μM的雷佐生即抑制A549細胞遷移，而AO/EB染色結果顯示50μM的雷佐生也不引起細胞凋亡。Transwell結果證明:10μM雷佐生顯著抑制A549細胞遷移，而apelin-13能夠廢除阿霉素

12、的抑制遷移作用，轉(zhuǎn)染pcMV-Tag2B-APLNR后A549細胞遷移明顯增加，與未轉(zhuǎn)染組細胞有明顯統(tǒng)計學差異，而轉(zhuǎn)染miR-APLNR-494的A549細胞，即使用apelin-13處理，雷佐生也顯著抑制A549細胞遷移。
　　7.缺氧誘導肺腺癌A549細胞APJ表達和apelin分泌
　　Western blot結果證實CoCl2處理A549細胞制造缺氧模型，可以時間和劑量依賴的促進A549細胞APJ表達，而ELISA結