DFMG對(duì)LPC誘導(dǎo)HUVE-12細(xì)胞角蛋白18磷酸化的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察新型金雀異黃素(genistein，GEN)類似物7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素(7-difluoromethoxy-5，4’-dimethoxygenistein，DFMG)拮抗溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE-12)凋亡是否涉及對(duì)角蛋白18磷酸化表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮HUVE

2、-12細(xì)胞，10μmol/L的LPC分別孵育細(xì)胞(6h、12h、24h和48h)，探索并確定LPC誘導(dǎo)HUVE-12細(xì)胞凋亡模型所需的時(shí)間。分別用0.3、1.0、3.0μmol/L的DFMG預(yù)處理HUVE-12細(xì)胞30分鐘，再與LPC孵育24小時(shí)。然后用AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，人細(xì)胞角蛋白18-M30定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)片段CK18的含量，westernblotting方法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18、Ser

3、33位和Ser52位磷酸化角蛋白18的表達(dá)，免疫共沉淀驗(yàn)證HUVE-12細(xì)胞K18/14-3-3復(fù)合物的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.10μmol/LLPC孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE-12)24h，增加CK18-M30的釋放，細(xì)胞培養(yǎng)液中CK18-M30的濃度達(dá)798.60±8.43mIU/ml，細(xì)胞凋亡率達(dá)30.98±2.04％，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中LPC誘導(dǎo)HUVE-12細(xì)胞凋亡模型的最佳造模時(shí)間。
　　

4、2.0.3、1.0、3.0μmol/L的DFMG使LPC誘導(dǎo)HUVE-12細(xì)胞CK18-M30釋放減少(P<0.001)，其細(xì)胞培養(yǎng)液的CK18-M30濃度分別是701.00±2.65mIU/ml，599.77±2.30mIU/ml，402.47±4.16mIU/ml，與10μmol/LLPC模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且作用呈濃度，效應(yīng)依賴性；較相同濃度GEN組(753.90±5.07mIU/ml，700.97±

5、3，60mIU/ml，548.83±3.98mIU/ml)減少CK18-M30的釋放作用更強(qiáng)(P<0.05)。
　　 3.0.3、1.0、3.0μmol/L的DFMG分別使LPC誘導(dǎo)HUVE-12細(xì)胞凋亡率下降到27.50±2.06%，23.52±2.59%，13.70±2.00%，與10μmol/LLPC模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且作用強(qiáng)于相同濃度GEN組(29.42±2.09%，27.57±0.76%

6、，24.29±2.49％)(P<0.05)。
　　 4.westernblotting結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，10μmol/LLPC使HUVE-12細(xì)胞Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表達(dá)上調(diào)，使未磷酸化角蛋白18表達(dá)下調(diào)，DFMG和GEN可呈濃度依賴性地拮抗LPC誘導(dǎo)的HUVE-12細(xì)胞Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表達(dá)，相同濃度的DFMG作用強(qiáng)于GEN。
　　 5.免疫共沉淀結(jié)果顯示：在提取

7、的HUVE-12細(xì)胞總蛋白中，在14-3-3抗體免疫沉淀下來(lái)的蛋白復(fù)合物中可以檢測(cè)到CK18，同時(shí)在CK18抗體免疫沉淀下來(lái)的蛋白復(fù)合物中也可以檢測(cè)到14-3-3蛋白，說(shuō)明CK18與14-3-3蛋白在HUVE-12細(xì)胞中存在相互作用。與正常對(duì)照組相比，10μmol/LLPC模型組14-3-3蛋白與CK18共沉淀增強(qiáng)。DFMG和GEN均能降低LPC誘導(dǎo)的HUVE-12細(xì)胞中14-3-3蛋白與CK18的結(jié)合水平，DFMG的這種作用強(qiáng)于GEN