氧化應(yīng)激和阿霉素誘導(dǎo)人類精子H2AX磷酸化及生物學(xué)意義.pdf

1、生殖毒性物質(zhì)包括多種物理以及化學(xué)因素，能夠引起人類生殖細(xì)胞DNA損傷。由于精子DNA損傷可能影響到正常受精和早期胚胎發(fā)育，甚至還有可能導(dǎo)致胎兒發(fā)育畸形以及子代先天遺傳疾病的發(fā)生。因此，了解精子細(xì)胞針對DNA損傷發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)，尋找敏感、特異的檢測精子DNA損傷方法將會有助于人們早期識別遺傳損傷因素、及時預(yù)防治療精子DNA損傷，從而減少男性不育以及妊娠不良結(jié)局的發(fā)生。 氧化應(yīng)激(Oxidativestress)是引起精子DNA損傷

2、的常見因素之一。在生理狀態(tài)下，活性氧類物質(zhì)(Reactiveoxygenspecies，ROS)具有調(diào)節(jié)成熟精子正常生理功能的作用；相反，ROS產(chǎn)生增加就會引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，精子細(xì)胞發(fā)生一系列病理改變，其中包括DNA損傷一而且此種情況常見于男性不育患者。然而，目前人們還不清楚DNA氧化損傷后精子細(xì)胞會發(fā)生什么樣的應(yīng)激反應(yīng)；另外，目前還缺少能夠用于臨床上檢測精子DNA氧化損傷的可靠方法。 阿霉素是一種常用于

3、腫瘤治療的化療藥物，它屬于另外一類的遺傳毒性化合物。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素主要通過引起細(xì)胞DNA損傷，進(jìn)而導(dǎo)致男性生殖功能異常。在發(fā)育成熟過程中，處于不同生長、分化階段的雄性生殖細(xì)胞對于化療損傷的易感性不同，因此阿霉素引起精子DNA損傷的程度、類型主要取決于遺傳毒物暴露時生殖細(xì)胞所處的生長發(fā)育成熟階段；而且由于晚期成熟階段精子DNA損傷修復(fù)能力較弱，因此對于化療藥物引起的損傷更加敏感。迄今為止，幾乎所有關(guān)于阿霉素引起精子DNA損傷的研究都集中

4、在細(xì)胞發(fā)育成熟的早期階段，而這種類型的細(xì)胞處在生長分裂旺盛時期；相反，對于減數(shù)分裂后期的生殖細(xì)胞一尤其是晚期成熟的精子細(xì)胞一DNA損傷的了解較少，而這些細(xì)胞處于分化終末期、基因轉(zhuǎn)錄暫時停止，同時也不再發(fā)生細(xì)胞分裂。 最近，~H2AX(磷酸化的組蛋白H2AX)被認(rèn)為是細(xì)胞DNA損傷，尤其是細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，敏感而且特異的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射以及其它引起遺傳損傷因素暴露均能夠迅速激活P13K家族激酶，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞H2AX發(fā)生

5、磷酸化形成~H2AX，隨后~H2AX在DNA損傷部位形成焦點(diǎn)。我們最近研究同樣發(fā)現(xiàn)，多種類型的物理化學(xué)因素均能夠誘導(dǎo)~H2AX焦點(diǎn)形成，而．I~．~H2AX焦點(diǎn)可以被用來評價(jià)細(xì)胞DNA損傷程度。此外，~H2AX焦點(diǎn)還能吸引其它細(xì)胞檢查點(diǎn)、DNA損傷修復(fù)蛋白Mretl／Rad50／Nbsl(MRN)，BRCAl，53BPl等形成復(fù)合體，介導(dǎo)細(xì)胞針對DSBs的應(yīng)激反應(yīng)，具有DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控以及細(xì)胞凋亡啟動等功能。因此，上述

6、相關(guān)蛋白的檢測有助于人們了解DNA損傷后細(xì)胞發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)，以及判斷DNA損傷細(xì)胞最終的命運(yùn)。 本研究分別利用不同劑量強(qiáng)度的H202和阿霉素在體外處理正常男性成熟精子細(xì)胞，然后觀察不同時間點(diǎn)精子細(xì)胞內(nèi)DNA損傷感受和修復(fù)蛋白~H2AX／53BPl／Rad50的動態(tài)變化，旨在從分子水平探討~H2AX作為人類精子DNA損傷指標(biāo)可行性以及了解精子針對DAN損傷發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。另外，本研究還選擇人體細(xì)胞FL作為精子的實(shí)驗(yàn)對照，并進(jìn)行同期

7、處理觀察。 結(jié)果發(fā)現(xiàn) LH202和阿霉素誘導(dǎo)精子DSBs產(chǎn)生 我們利用中性彗星實(shí)驗(yàn)(Cometassay)，一種經(jīng)典的在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷的方法，檢測DNA雙鏈斷裂(DSBs)，并以尾矩(Tailmoment，TM)表示DNA損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H202和阿霉素均能誘導(dǎo)精子DNA發(fā)生雙鏈斷裂(DSBs)，并且在一定范圍內(nèi)呈時間一劑量依賴效應(yīng)。盡管H2O2暴露短時間內(nèi)(0.5mM，30min)以及低濃度H2

8、O2(O．1mM，8h)條件下并不能促使TM明顯增加，而隨著濃度增加或者作用時間延長TM增加均十分顯著。相反，研究發(fā)現(xiàn)阿霉素在各個劑量組(O．4，2，10~g／m1)以及時間點(diǎn)(O.5，2，8，24h)均能使精子TM增加。 2.H202和阿霉素誘導(dǎo)精子H2AX磷酸化 免疫熒光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，H202和阿霉素均能誘導(dǎo)精子H2AX磷酸化，而且流式細(xì)胞分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)H2AX磷酸化水平與H202和阿霉素劑量強(qiáng)度、作用時間成正相

9、關(guān)。但是，~H2AX在精子細(xì)胞核內(nèi)分布呈現(xiàn)均一的陽性染色，這與人FL體細(xì)胞核內(nèi)~H2AX焦點(diǎn)表現(xiàn)明顯不同的分布特征。上述結(jié)果提示，遺傳毒物H202和阿霉素能夠誘導(dǎo)精子細(xì)胞核內(nèi)H2AX發(fā)生磷酸，而且其磷酸化水平呈現(xiàn)劑量一時間依賴效應(yīng)；精子細(xì)胞內(nèi)~H2AX分布特征與體細(xì)胞明顯不同，其分布差異可能反應(yīng)了生殖細(xì)胞特殊的生物學(xué)功能特征。 3.Wortmannin抑制人精子細(xì)胞內(nèi)H2AX發(fā)生磷酸化 研究發(fā)現(xiàn)PI-3K家族激酶抑制物w

10、ortmannin能夠抑制IR和復(fù)制壓力所誘導(dǎo)的H2AX的磷酸化。因此，我們進(jìn)一步觀察了wortmannin對于氧化應(yīng)激損傷以及阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生~H2AX的影響。為減少wortmannin降解，精子在H202或者阿霉素處理前用wortmannin孵育30分鐘，并在處理后2h給予第二個劑量，8h后收集精子進(jìn)行H2AX標(biāo)記，用于免疫熒光鏡下檢測或者流式細(xì)胞分析。免疫熒光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)wortmannin處理完全抑制H202或者阿霉素誘導(dǎo)的H2A

11、X的磷酸化，流式細(xì)胞分析結(jié)果同樣顯示，wortmannin促使處理后H202精子細(xì)胞~H2AX平均熒光強(qiáng)度以及~H2AX陽性細(xì)胞百分率均明顯降低，接近藥物處理前水平。因此，H202和阿霉素所誘導(dǎo)的H2AX磷酸化依賴于PI-3K家族激酶。4.H202和阿霉素誘導(dǎo)精子γH2AX、RadS0和53BPl共定位 研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞DNA損傷誘導(dǎo)H2AX磷酸化形成~H2AX，隨后募集其它DNA損傷修復(fù)蛋白因子如53BPl以及Rad50，在D

12、NA損傷位點(diǎn)形成復(fù)合體，參與DNA損傷修復(fù)以及凋亡啟動等細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察H202或者阿霉素誘導(dǎo)人類精子DNA損傷過程中~H2AX、Rad50和53BPl變化以及相互關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨精子DNA損傷過程中H2AX磷酸化，Rad50和53BPl同時出現(xiàn)在精子細(xì)胞核內(nèi)，但是其分布呈現(xiàn)均一的陽性染色：相反，相同條件下，人FL細(xì)胞則表現(xiàn)Rad50和53BPl焦點(diǎn)形成，而且焦點(diǎn)與γH2AX呈現(xiàn)明顯的共定位現(xiàn)象。 5．去

13、除損傷因素后精子~／I-12AX變化以及DNA損傷修復(fù) ~H2AX修復(fù)系統(tǒng)在體細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過程中具有重要作用，~H2AX焦點(diǎn)消失提示DNA損傷修復(fù)已經(jīng)完成，因而被認(rèn)為是反應(yīng)DNA修復(fù)能力的客觀指標(biāo)。由于通常認(rèn)為人類成熟精子已經(jīng)暫時失去DNA損傷修復(fù)能力，那么推測去除損害因素后，~H2AX應(yīng)該持續(xù)存在。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，精子細(xì)胞處理兩小時后去除H202，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)~H2AX持續(xù)存在，而且流式細(xì)胞分析結(jié)果也證實(shí)~H2AX免疫

14、熒光強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞百分比均無明顯變化。然而，體細(xì)胞FL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去除損害因素H202后，~H2AX迅速消失，至4h已經(jīng)完全恢復(fù)到處理前的水平。上述結(jié)果提示，人類成熟精子暫時失去DNA損傷修復(fù)能力，而~H2AX、Rad50以及53BP!出現(xiàn)并不具備修復(fù)DNA損傷功能或者其修復(fù)功能缺陷。 根據(jù)上述結(jié)果，可以得出以下結(jié)論： 1.H2O2和阿霉素均能夠誘導(dǎo)精子H2AX發(fā)生磷酸化，而且呈現(xiàn)劑量一時間依賴效應(yīng)：精子H2AX磷酸化依