細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中受PRAK調(diào)控的磷酸化蛋白的鑒定.pdf

1、氧自由基,也稱活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),包括超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO·)等,是細(xì)胞內(nèi)多種正常代謝過程的產(chǎn)物并在生物體中扮演著雙重角色。在活性氧簇處于低濃度或者適當(dāng)濃度時,它對細(xì)胞免疫應(yīng)答非常關(guān)鍵,如在對抗感染原以及相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到重要作用,同時還參與有絲分裂的應(yīng)答過程;但是當(dāng)體內(nèi)活性氧簇過量時,由于氧自由基會對生物體造成傷害,因此

2、會引發(fā)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress response)就是指當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇水平高于細(xì)胞的抗氧化能力時產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)。氧化應(yīng)激與多種病理過程相關(guān),包括心血管疾病、癌癥、神經(jīng)紊亂、糖尿病等,也是衰老的罪魁禍?zhǔn)?。通?抗氧化酶或其他抗氧化物缺陷時會發(fā)生氧化應(yīng)激,即當(dāng)機(jī)體產(chǎn)氧與抗氧化反應(yīng)失衡時即發(fā)生氧化應(yīng)激。
　　 研究已經(jīng)證實(shí),高濃度的活性氧簇會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等造成損傷。其中,羥自由

3、基(·OH)可以與DNA分子的所有組份發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致嘌呤,嘧啶以及脫氧核糖骨架的損傷;金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧簇不僅攻擊DNA,還會對氧化敏感的磷脂不飽和脂肪酸殘基造成損傷;活性氧簇還能夠?qū)Ρ┞队诹u自由基或者羥/超氧化物自由基混合物中的氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行離子輻射,從而導(dǎo)致對蛋白質(zhì)的氧化損傷。
　　 由于機(jī)體經(jīng)常暴露于各種來源的自由基、活性氧簇中,為了保持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)定狀態(tài),機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了一系列的抗氧化機(jī)制,包括預(yù)防機(jī)制、修

4、復(fù)機(jī)制、物理防衛(wèi)和抗氧化防衛(wèi)等。在有機(jī)體的主要抗氧化系統(tǒng)中,谷胱甘肽和硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)在細(xì)胞內(nèi)的氧化還原動態(tài)平衡中起到了氧化還原緩沖的作用。因此,細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)實(shí)際上就是由活性氧簇的產(chǎn)生速率與各種抗氧化物對其的清除速率決定的,維持活性氧簇的平衡,即氧化還原調(diào)控,成為機(jī)體內(nèi)維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的一個非常重要的方面。
　　 氧化還原調(diào)控過程就是保護(hù)機(jī)體免受各種氧化應(yīng)激反應(yīng),并且通過控制氧化還原狀態(tài)從而維持體內(nèi)氧

5、化還原的動態(tài)平衡。一系列研究表明在真核細(xì)胞中,有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。已知的MAPK家族包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-regulatedkinases,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-jun-NH2-terminal kinases,JNK),p38MAPK和大絲裂原活化蛋白激酶1(bi

6、g MAPK-1,BMK-1)。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NADPH oxidase1,NOX1)功能產(chǎn)物、過氧化物和過氧化氫等氧化產(chǎn)物均可激活MAPK在MEK和ERK1/2水平上的信號級聯(lián)。有研究表明,MAPK氧化應(yīng)激過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是類型特異性和刺激特異性的,內(nèi)源性過氧化氫激活ERK而不激活p38激酶;相反,外源性的過氧化氫激活p38激酶而非ERK。
　　 PRAK(p38 regulated/activa

7、ted kinase)即MK5,發(fā)現(xiàn)于1998年,為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一種受p38調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PRAK與其他受p38調(diào)控的MK族蛋白均存在核定位和核輸出信號,但是特別的是,PRAK的兩個定位信號有部分序列重疊,提示PRAK蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位方面有特殊的調(diào)控機(jī)制,也提示其在功能方面相比于其他MKs存在特殊之處。目前對PRAK功能方面的研究較少,根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)表明,在受到外源性過氧化氫刺激時PRAK-/-型小鼠胚胎成纖維細(xì)

8、胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)凋亡率明顯高于PRAK+/+型細(xì)胞,提示PRAK蛋白在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中扮演著重要的角色。但是上述作用的具體機(jī)制尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)的目的即在于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中受到PRAK磷酸化調(diào)控的蛋白質(zhì),從而揭示PRAK蛋白參與細(xì)胞氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)過程的具體途徑。
　　 傳統(tǒng)的研究思路通常是研究者根據(jù)已有的工作基礎(chǔ)和文獻(xiàn)報(bào)道,通過分析并預(yù)測得到在特定過程中有可能與目的蛋白

9、發(fā)生相互作用的一個或幾個重要分子,進(jìn)而進(jìn)行深入細(xì)致的功能研究。但是這種傳統(tǒng)研究策略應(yīng)用于本研究卻缺乏可行性,并存在著局限性。首先,目前對PRAK已有的研究報(bào)道較少,難以為分析預(yù)測提供充分可靠而有效的理論支持;其次,傳統(tǒng)的研究結(jié)果僅僅局限于一個或幾個蛋白,說明的科學(xué)問題也僅僅停留在“點(diǎn)”的階段,很難從整體上水平上解釋復(fù)雜的生命現(xiàn)象。不僅如此,機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)是處于是高度動態(tài)變化的,即使同一細(xì)胞在不同生理或病理環(huán)境中,其蛋白表達(dá)的時空差異性也

10、是不同的,而這種差異蛋白往往恰是某些疾病發(fā)生的標(biāo)志?；谏鲜龅目紤],我們在研究過程中采用了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是獨(dú)立于基因組學(xué)發(fā)展起來的一門新興的前沿學(xué)科,它在特定的時間和空間研究一個完整的生物體或細(xì)胞所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的特征,包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用等,從而在蛋白質(zhì)水平上獲得對于生物體生理、病理等過

11、程的全面認(rèn)識,具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)。利用比較蛋白質(zhì)組研究技術(shù),我們可以批量觀察細(xì)胞在正常與應(yīng)激狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)譜上的差異,從整體水平上規(guī)模化地篩選和發(fā)掘潛在的功能蛋白點(diǎn),從而大大加快我們對蛋白質(zhì)功能及其調(diào)節(jié)過程的認(rèn)識。
　　 由于整個細(xì)胞或組織的蛋白組成極其復(fù)雜,蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展對于研究技術(shù)手段有著較高的要求,推動了多項(xiàng)前沿生物研究技術(shù)的革新與發(fā)展,其中就包括了熒光差異雙向電泳技術(shù)(fluorescence dif

12、ference gel electrophoresis,DIGE)。DIGE技術(shù)是經(jīng)典雙向電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)的成熟與完善,通過三色熒光染料分別對內(nèi)標(biāo)和生物樣本進(jìn)行標(biāo)記,能夠在一張2-DE膠上對兩個樣本的多種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,并分別單獨(dú)成像,應(yīng)用DeCyder2-DE軟件分析圖像,得到蛋白表達(dá)量的豐度變化,根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)差異蛋白。使用內(nèi)標(biāo)、正反標(biāo)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

13、有效消除膠內(nèi)和膠間差異,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好。全自動軟件分析對蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn),降低由實(shí)驗(yàn)因素、數(shù)據(jù)分析和生物種群間固有個體差異等引起的系統(tǒng)誤差至最小,確保定性的準(zhǔn)確度。
　　 蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)是生物界最普遍,也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,很多重要蛋白質(zhì)的活性是通過翻譯后修飾過程來進(jìn)行調(diào)節(jié)的?？梢灶A(yù)測,PRAK作為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它

14、對下游蛋白的調(diào)控作用很可能也是通過使后者發(fā)生磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。因此,在本課題研究中,我們采用定量技術(shù)分別對亞砷酸鈉刺激前后PRAK+/+與PRAK-/-型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行差異定量分析,以期尋找一批在氧化應(yīng)激過程中受PRAK磷酸化調(diào)控的下游功能蛋白。該項(xiàng)工作的開展不僅能夠幫助我們?nèi)娑钊氲恼J(rèn)識PRAK在氧化應(yīng)激過程中所承擔(dān)的細(xì)胞調(diào)節(jié)功能,并且對于闡明內(nèi)源性抗氧化通路具有重要意義。
　　 基于上述思考,本實(shí)驗(yàn)的

15、研究內(nèi)容為:
　　 (1)分別用亞砷酸鈉刺激(NaAsO245min)PRAK+/+與PRAK-/-型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞;
　　 (2)利用金屬磷酸鹽親和層析樹脂富集磷酸化蛋白;
　　 (3)采用DIGE技術(shù)對磷酸化蛋白進(jìn)行分離,并建立相應(yīng)的差異蛋白圖譜;
　　 (4)通過DeCyder差異分析軟件分析后找到差異蛋白點(diǎn)
　　 (4)對這些差異蛋白點(diǎn)利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定

16、
　　 (5)對鑒定出的蛋白質(zhì)從功能,定位,相互作用等方面進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 綜上所述,我們的研究得出以下幾點(diǎn)結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用金屬磷酸鹽親和層析樹脂成功富集了PRAK+/+和PRAK-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)磷酸化蛋白。利用DIGE技術(shù)成功分離并建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。通過相應(yīng)的軟件分析,得到了32個具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白點(diǎn);
　　 2.對32個差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,去除角蛋白污染

17、和重復(fù)蛋白后,共鑒定出16種蛋白,其中發(fā)現(xiàn)有13種蛋白為已經(jīng)確證的磷酸化蛋白質(zhì);
　　 3.對16種差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),定位于胞漿的有8個;1個蛋白完全定位于細(xì)胞膜;1個蛋白完全定位于線粒體;3個蛋白分泌到胞外;3個蛋白可能存在胞漿與胞核間的穿梭;
　　 4.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白包括膜蛋白,離子通道蛋白,細(xì)胞骨架蛋白,氧化還原酶,細(xì)胞因子;說明氧化應(yīng)激應(yīng)答過程中PRAK通過磷酸化調(diào)控細(xì)胞功能的多

18、個方面。
　　 5.String軟件預(yù)測鑒定的差異蛋白,其中彼此有相互作用的較少,可能是由于質(zhì)譜鑒定丟失了部分差異點(diǎn)造成,也可能是由于目前對PRAK已有的研究較少,無法為相互作用的預(yù)測提供充足的依據(jù)。
　　 6.分析這16種蛋白在兩組細(xì)胞中的刺激前后磷酸化水平變化情況,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激過程中,有些蛋白直接受到PRAK調(diào)控磷酸化水平上調(diào),在PRAK+/+細(xì)胞刺激后磷酸化水平明顯上調(diào)而在PRAK-/-細(xì)胞刺激后變化不明顯;與上述