熱應(yīng)激對小G蛋白RhoB的誘導(dǎo)作用、機(jī)制及生物學(xué)意義.pdf

1、熱應(yīng)激可由環(huán)境溫度過高(如燒傷、燙傷)或體內(nèi)的溫度增高(如發(fā)熱)所致，熱應(yīng)激可以激活多條細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)應(yīng)激基因的快速表達(dá)，以合成多種特異性和非特異性的對細(xì)胞具有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白。小G蛋白RhoB是Rho亞家族的成員之一，國外近年來研究表明，RhoB是一個早期反應(yīng)基因，能夠被多種基因毒應(yīng)激原，如放射線、紫外線、抗癌藥(如5．氟脲嘧啶、順鉑)等誘導(dǎo)或使其激活。有報道RhoB上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡。但是作為非基因毒應(yīng)

2、激的熱應(yīng)激是否影響RhoB的表達(dá)未見報道。本課題從在體和離體兩個水平觀察了熱應(yīng)激對RhoB表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究了RhoB表達(dá)改變的機(jī)制以及可能的生物學(xué)意義，以期為臨床燒傷、燙傷等疾病的救治提供新的靶點(diǎn)。 一、燙傷和熱應(yīng)激能夠上調(diào)RhoB的表達(dá) 首先制備了30％體表面積Ⅲ度燙傷大鼠模型，采用RT-PCR及Western blot方法檢測了肝和肺組織中RhoB mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠肝，肺組織中RhoB

3、 mRNA在燙傷后2h時即上調(diào)，4h時達(dá)到最大值，約為對照組的3～4倍(p<0.01)。由于燙傷后體內(nèi)會產(chǎn)生一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，而我們以往的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)糖皮質(zhì)激素(GC)可以誘導(dǎo)RhoB的表達(dá)。為排除體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌因素，確定熱應(yīng)激本身是否可直接上調(diào) RhoB，我們進(jìn)一步觀察了熱應(yīng)激對體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞和人前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞中RhoB表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，熱應(yīng)激本身能以時間依賴性的方式快速地誘導(dǎo)這兩種

4、體外培養(yǎng)細(xì)胞中RhoB mRNA和蛋白的表達(dá)。表明熱刺激在體內(nèi)和體外都可以上調(diào)RhoB的表達(dá)，這種作用無明顯的組織細(xì)胞特異性。 二、熱應(yīng)激上調(diào)RhoB表達(dá)的機(jī)制研究 以RAW264.7細(xì)胞模型，我們對熱應(yīng)激上調(diào)RhoB表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。我們用放線菌素D抑制RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，觀察了熱應(yīng)激對RhoB mRNA的穩(wěn)定性的影響，以明確熱應(yīng)激誘導(dǎo)RhoB表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，還是在轉(zhuǎn)錄后水平，結(jié)果顯示，在RAW26

5、4.7細(xì)胞中熱應(yīng)激能使RhoB的半衰期由3.98h增加至7．6h(p<0.01)，表明熱應(yīng)激RhoB mRNA的增加主要由RhoB的穩(wěn)定性增加所致。 已證實(shí)p38 MAPK信號通路能被包括熱應(yīng)激在內(nèi)的多種應(yīng)激原激活，我們因而觀察了p38 MAPK的抑制劑SB203580對熱應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞RhoB表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入SB203580抑制p38 MAPK的激活后，再將細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理，RhoB的

6、誘導(dǎo)水平比沒經(jīng)SB203580處理細(xì)胞降低了約50％，表明p38 MAPK通路參與了熱應(yīng)激對RAW264.7細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用。 三、RhoB上調(diào)對SGK和HSP70表達(dá)的影響 血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶 (serum and glucocorticoid-regulated proteinkinase，SGK)是一個與PI-3K下游的PKB/AKT具有高度同源性的蛋白激酶，能被糖皮質(zhì)激素、血清以及多種應(yīng)激原所誘導(dǎo)

7、，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)顯示，在RAW264.7細(xì)胞中，SGK也能被熱應(yīng)激所誘導(dǎo)。因此我們進(jìn)一步觀察了RhoB表達(dá)量的改變對SGK的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染RhoB-wt質(zhì)粒使RhoB過表達(dá)的細(xì)胞熱應(yīng)激后，SGK mRNA的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞明顯增高(約2.1倍，p<0.01)，相反通過轉(zhuǎn)染siRhoB質(zhì)粒抑制RhoB表達(dá)的細(xì)胞熱應(yīng)激后SGK mRNA的表達(dá)量明顯減少。表明在熱應(yīng)激后，RhoB的上調(diào)可

8、能通過使SGK的表達(dá)增多，在熱應(yīng)激時起促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。 熱應(yīng)激能夠誘導(dǎo)熱休克蛋白(HSPs)的表達(dá)，HSP對于維持細(xì)胞生存、促進(jìn)細(xì)胞生存具有重要的作用。我們采用上述同樣的方法觀察了熱應(yīng)激前后RhoB表達(dá)量的改變對HSP70表達(dá)的影響，結(jié)果表明熱應(yīng)激時RhoB表達(dá)量的改變不影響HSP70 mRNA的表達(dá)。 綜上述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激能夠在整體水平和細(xì)胞水平誘導(dǎo)RhoB的表達(dá)，這種誘導(dǎo)沒有明顯組織和細(xì)胞的特異性，熱應(yīng)激能