鉛誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮氧化應(yīng)激應(yīng)答機制及其細胞生物學(xué)特征.pdf

1、視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium, RPE)是位于神經(jīng)視網(wǎng)膜與脈絡(luò)膜血管層之間一單層細胞,由神經(jīng)外胚層分化而來。正常的 RPE層對于視細胞結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能的維持以及視周期的順利進行起著極為關(guān)鍵的作用。當(dāng)RPE發(fā)生病變,會引起一系列視網(wǎng)膜疾病。目前就 RPE發(fā)生病變的機制并未完全闡明,但這些視網(wǎng)膜病變疾病通常都伴隨有 RPE細胞氧化應(yīng)激(oxidative stress)的發(fā)生。這成為了視網(wǎng)膜病變相

2、關(guān)疾病機制研究的一個重要突破口。目前已經(jīng)知道誘發(fā) RPE產(chǎn)生氧化應(yīng)激的因素主要有超氧陰離子自由基、藍光輻射、致毒性物質(zhì)的攝入、吸煙、肥胖等等。有研究發(fā)現(xiàn)重金屬鉛經(jīng)個體吸收后在體內(nèi)會誘發(fā)某些細胞或組織產(chǎn)生自由基,這些成分會進一步導(dǎo)致細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激應(yīng)答并嚴重干擾細胞內(nèi)環(huán)境還原穩(wěn)態(tài)。此外,早年有報道發(fā)現(xiàn)重金屬鉛、鎘在眼底會發(fā)生沉著,而且在 RPE層蓄積明顯。因此,我們懷疑慢性鉛暴露是否也是誘發(fā) RPE產(chǎn)生氧化應(yīng)激并進一步導(dǎo)致其發(fā)生病變的潛在

3、病因?qū)W因素。
　　本課題主要以本實驗室建立的胎兒 RPE細胞系 fRPE-13及當(dāng)下常用 RPE系A(chǔ)RPE19作為主要的實驗材料,RPE經(jīng)不同濃度梯度鉛染培養(yǎng)后,通過觀察細胞形態(tài)學(xué)變化、鑒定氧化應(yīng)激相關(guān)通路的分子表達差異以及對視網(wǎng)膜色素上皮生理學(xué)功能的測定與評價,來確認重金屬鉛是否也是誘發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮氧化損傷的一個重要病理學(xué)因素。研究結(jié)果小結(jié)如下:
　　1、急性染鉛培養(yǎng)72 hr,用 CCK-8法測定在各個鉛劑量組 RPE

4、細胞活率。結(jié)果顯示,無論是胎兒來源的 fRPE-13還是成年來源的 ARPE-19,都存在低劑量鉛(≤20μM)興奮性效應(yīng);而劑量高于50μM時,RPE細胞活率下降顯著;此外,RPE對鉛的可耐受性高于以往研究的其他類型細胞。我們并且由此確定了后續(xù)實驗鉛的考察劑量:0μM、10μM、50μM、250μM。
　　2、RPE細胞經(jīng)間隔12 hr連續(xù)的慢性染鉛培養(yǎng)3天、5天、8天,細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。鉛染培養(yǎng)3天,0μM與10μM組細胞

5、飽滿生長旺盛,呈眾小島樣,50μM、250μM組呈小島樣細胞相對較少,長勢緩慢;染鉛培養(yǎng)5天后, fRPE-13的10μM組培養(yǎng)皿外圍細胞已開始皺縮;ARPE-19的50μM組細胞則成狹長彎鉤狀,而250μM組已經(jīng)完全成皺縮樣;當(dāng)染鉛培養(yǎng)8天后,fRPE-13中10μM組則大范圍開始出現(xiàn)細胞皺縮,而 ARPE-19的10μM組細胞也出現(xiàn)鵝卵石樣上皮,但是細胞形態(tài)大小不一且不規(guī)整;50μM組與250μM組細胞則已經(jīng)完全皺縮。
　　3

6、、細胞滿板后,劃痕,并連續(xù)鉛染培養(yǎng)3天,間隔一定時間在光鏡下記錄細胞遷移情況。采用計算空白區(qū)像素大小的方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明,當(dāng)鉛濃度達到50μM,無論是 fRPE-13還是 ARPEA19,上皮的遷移能力幾乎完全受到了抑制;而即使是低濃度鉛(10μM)也會降低 RPE細胞的劃痕愈合能力,這種對上皮創(chuàng)傷愈合能力的抑制作用呈劑量依賴特征。
　　4、細胞經(jīng)慢性鉛染培養(yǎng)5天后,收集并重新鋪入96孔板中連續(xù)培養(yǎng)7天,采用 CCK-8

7、法每隔24 hr測定其細胞活率,并繪制細胞生長曲線。結(jié)果顯示生長曲線右移,表明鉛降低了 RPE的增值活性。
　　5、依據(jù) RPE細胞生長曲線的特點,當(dāng)染鉛或無鉛培養(yǎng)3.5天后達到對數(shù)生長期,收集細胞進行固定、PI染色并進行流式周期分析。結(jié)果表明,與不染鉛組相比,低劑量(10μM)染鉛組進入 S與 G2M期細胞明顯增多,這進一步印證了低劑量鉛的興奮性效應(yīng);而隨著鉛濃度高于50μM,進入分裂相的細胞開始減少。
　　6、RPE細胞

8、經(jīng)慢性鉛染培養(yǎng)5天,Trizol法提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后進行 qPCR檢測。結(jié)果表明鉛能夠誘導(dǎo)分子伴侶(如抗增值蛋白、HSP70)、抗氧化蛋白與酶均表達上調(diào)等一系列氧化應(yīng)激應(yīng)答成員的高表達。此外,氧化應(yīng)激應(yīng)答關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Nrf2的表達也發(fā)生顯著上調(diào)。
　　7、RPE細胞經(jīng)慢性鉛染培養(yǎng)5天,收集貼壁或未貼壁細胞進行流式凋亡分析。結(jié)果顯示細胞凋亡率呈鉛劑量依賴性特征。
　　綜上所述,從 RPE細胞形態(tài)學(xué)、生理