Bevacizumab對(duì)體外培養(yǎng)的豬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、目的:Bevacizumab進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注射治療眼內(nèi)各種新生血管性疾病,目前已經(jīng)成為眼科領(lǐng)域的新熱點(diǎn),有關(guān)報(bào)道(1,2,3)相繼發(fā)表于世,患者的視功能均有不同程度恢復(fù)和提高,然而對(duì)于其遠(yuǎn)期療效,目前各國(guó)學(xué)者還沒(méi)有進(jìn)行大量的長(zhǎng)期隨訪和前瞻性隨機(jī)臨床研究。當(dāng)一種藥物應(yīng)用于局部,我們應(yīng)該了解其對(duì)靶部位不同組織有無(wú)潛在毒性影響,有關(guān)Bevacizumab對(duì)體外培養(yǎng)的豬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,國(guó)內(nèi)外臨床和基礎(chǔ)研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)豬

2、RPE細(xì)胞來(lái)觀察Bevacizumab對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響。
　　 方法:
　　 1豬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)
　　 1.1摘取豬眼球,去除眼前節(jié)和視網(wǎng)膜神經(jīng)層,用胰酶消化法培養(yǎng)豬原代RPE細(xì)胞。
　　 1.2把剝離下來(lái)的視網(wǎng)膜神經(jīng)層以1000r/min-1離心5min,加少許培養(yǎng)液,輕吹,吸出上層懸浮的顏色較深的液體,接種于培養(yǎng)瓶中。
　　 1.3細(xì)胞鑒定:免疫熒光,透射電鏡兩種方法對(duì)RPE

3、細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 2 Bevacizumab對(duì)體外培養(yǎng)的豬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞毒性作用
　　 2.1把培養(yǎng)的第3代RPE細(xì)胞接種于96孔板中,分別加入終濃度為0,0.125,0.5,1.0,1.25,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分別于12h,24h,48h,72h后,MTT比色法測(cè)定藥物對(duì)RPE增生的影響。
　　 2.2根據(jù)MTT結(jié)果,將培養(yǎng)的第3代細(xì)胞中加入終濃度為2.0,2.5mg/m

4、l的Bevacizumab,培養(yǎng)72小時(shí)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bevacizumab對(duì)RPE細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 2.3第三代RPE細(xì)胞,加入終濃度為2.0mg/ml的bevacizumab作用72h后,透射電鏡觀察RPE細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 3 Bevacizumab對(duì)豬視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞吞噬和移行功能的影響
　　 3.1 ROS制備和FITC熒光標(biāo)記,細(xì)胞色素的制備
　　 室溫下,

5、于暗處用終濃度為10ug/ml的FITC液孵育提取的ROS1小時(shí),然后以細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1×107/ml。
　　 原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),在第二次換液時(shí),吸取培養(yǎng)瓶下部1/2培養(yǎng)液,用培養(yǎng)液稀釋,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 3.2 RPE細(xì)胞的培養(yǎng)及標(biāo)記
　　 采用胰蛋白酶消化法。把培養(yǎng)的第3代RPE細(xì)胞接種于24孔板中,分別加入終濃度為0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分別于12

6、h,24h,48h,72h后,用含有終濃度為40ug/mlSR的生長(zhǎng)液孵育RPE細(xì)胞36小時(shí)。
　　 3.3吞噬動(dòng)力學(xué)觀察
　　 向每個(gè)培養(yǎng)孔(24孔板)中加入1×107/ml的FITC-ROS50ul,進(jìn)行孵育24h。將孵育液吸出,以4℃的無(wú)血清DMEM沖洗二次,以終止吞噬。在熒光顯微鏡下觀察吞噬量。
　　 3.4非特異性吞噬實(shí)驗(yàn)
　　 采用胰蛋白酶消化法,把培養(yǎng)至無(wú)色素的第7代RPE細(xì)胞接種于96孔板

7、中,分別加入終濃度為0,0.25,1.0,2.0,2.Smg/ml的Bevacizumab分別于12h,24h,48h,72h后,將培養(yǎng)液吸出,每孔加入含色素的培養(yǎng)液60ul,24h后洗凈,用405nm波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)RPE吞噬色素量。
　　 3.5檢測(cè)對(duì)RPE細(xì)胞移行能力的影響
　　 將培養(yǎng)的第3代RPE細(xì)胞以5×104個(gè)每孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,分別加入終濃度為0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/m

8、l的Bevacizumab,分別于12h,24h,48h,72h后,將培養(yǎng)液吸出,制造RPE細(xì)胞損傷模型,無(wú)血清培養(yǎng)48h,HE染色,計(jì)數(shù)進(jìn)入刮痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)的豬原代RPE細(xì)胞生長(zhǎng)良好,有的呈集落式生長(zhǎng),細(xì)胞呈不規(guī)則形,接近融合時(shí)近六邊形,傳代穩(wěn)定,透射電鏡表明細(xì)胞內(nèi)含大量色素,免疫熒光鑒定抗角蛋白抗原陽(yáng)性；
　　 2.通過(guò)MTT法檢測(cè),2.0-2.5mg/ml濃度范圍內(nèi),與對(duì)照

9、組比較,Bevacizumab作用72h后RPE細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯抑制(p<0.05),且呈濃度依賴(lài)性；
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,Bevacizumab組S期細(xì)胞較對(duì)照組減少,細(xì)胞凋亡與對(duì)照組無(wú)差異；
　　 4.透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),Bevacizuman組細(xì)胞微絨毛減少,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和髓鞘樣變性；
　　 5.與對(duì)照組相比,Bevacizumab的任何濃度和任何時(shí)間段對(duì)RPE細(xì)胞的特

10、異性吞噬和非特異性吞噬都沒(méi)有影響；
　　 6.Bevacizumab在2.0-2.5mg/ml濃度范圍內(nèi),與對(duì)照組比較,Bevacizumab作用48h后可明顯抑制RPE細(xì)胞移行。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功的培養(yǎng)了豬原代RPE細(xì)胞,并最大化的收集了RPE細(xì)胞,細(xì)胞保持正常增殖能力,免疫熒光鑒定抗角蛋白抗原陽(yáng)性,所采用方法與人RPE細(xì)胞培養(yǎng)相近,來(lái)源,取材不受限制,操作更方便,可以在某些方面代替人RPE細(xì)