Racl-siRNA載體轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外實驗.pdf

1、目的： 視網(wǎng)膜新生血管及其并發(fā)癥嚴(yán)重?fù)p害視功能，由于其發(fā)病機(jī)理尚未完全明了，因此目前仍無確切有效的藥物治療方法。缺氧條件下RPE細(xì)胞中VEGF表達(dá)增加對毛細(xì)血管內(nèi)皮的增殖起著重要的作用，提示RPE細(xì)胞可以作為抗視網(wǎng)膜新生血管生成基因治療的靶細(xì)胞，而研究表明Racl可能是調(diào)控多種血管生成相關(guān)因素的關(guān)鍵分子。本實驗通Racl-siRNA載體轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外實驗，研究Racl對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步探討Racl

2、治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的可能性提供實驗性理論依據(jù)。 方法： ①常規(guī)培養(yǎng)RPE細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至50％融合狀態(tài)時，加入脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染載體，培養(yǎng)24h后觀察細(xì)胞的形態(tài)及轉(zhuǎn)染效率。 ②同法轉(zhuǎn)染載體后使用125umol/L的COCl<,2>行缺氧處理。 ③24h后熒光顯微鏡下觀測熒光，計算轉(zhuǎn)染效率；顯微鏡下觀測細(xì)胞的形態(tài)。 ④MTT法檢測對細(xì)胞增殖的影響。 ⑤使用RT-PCR及免疫細(xì)胞化

3、學(xué)方法檢測Racl、VEGF、HIF-1α和NF K-B的表達(dá)。 結(jié)果： ①Racl-siRNA載體體外轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞后觀察細(xì)胞，形態(tài)沒有明顯的改變，當(dāng)載體的轉(zhuǎn)染濃度為3ug/L時轉(zhuǎn)染有較高的效率：15～20％。 ②以3ug/L的轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞，使用125umol/L的COCl<,2>行缺氧處理24h后，觀察細(xì)胞形態(tài)無明顯改變；轉(zhuǎn)染效率無明顯變化，為15～20％。 ③用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的