環(huán)孢霉素A抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy,PVR)為視網(wǎng)膜表面發(fā)生無血管的纖維細(xì)胞性的膜的增生，常見于原發(fā)性(孔源性)視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜脫離復(fù)位手術(shù)后或眼球穿通傷后。是引起視網(wǎng)膜再脫離的主要原因，也是造成許多眼底疾病繼續(xù)惡化、視力喪失的重要原因，近年來已經(jīng)成為眼科研究的熱點(diǎn)之一。 PVR的發(fā)病機(jī)制目前還未完全清楚，但其發(fā)生發(fā)展的病理過程已經(jīng)明確。實(shí)驗(yàn)及臨床觀察證明，PVR的病理發(fā)展過程

2、大致分為3個階段，即炎癥反應(yīng)期、增生期及瘢痕重塑期。而視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細(xì)胞的增生是則是PVR的主要病理特征。RPE細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等在細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)的作用下，遷移至視網(wǎng)膜表面及玻璃體腔，增生附著于一切可能的界面，并發(fā)生收縮。RPE主要作用為聚集纖維，造成玻璃體收縮，膠質(zhì)細(xì)胞則為RPE細(xì)胞提供附著點(diǎn)，將RPE細(xì)胞產(chǎn)生的收縮力傳遞給視網(wǎng)膜，從而造成視網(wǎng)膜脫離。所以RP

3、E細(xì)胞在PVR的發(fā)生過程中起著重要作用。 PVR的治療也是近10年研究的熱點(diǎn)，其中玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)治療PVR也早已開展，手術(shù)的目的為封閉裂孔、緩解PVR對視網(wǎng)膜的牽引，通常需要剝離視網(wǎng)膜前膜、視網(wǎng)膜下膜、并切除玻璃體。雖然手術(shù)成功率高，但卻不能從根本上抑制細(xì)胞的增生。為了提高治療PVR的成功率，很多研究都嘗試用藥物抑制細(xì)胞增生而達(dá)到治療PVR的目的。 由于RPE細(xì)胞與PVR的關(guān)系極為密切，藥物治療自然也就集中在RPE細(xì)胞

4、上，通過某種藥物的作用來抑制RPE細(xì)胞的移行及增生，也就達(dá)到了治療目的。 環(huán)孢霉素A(cyclosporine，CsA)是從真菌的代謝產(chǎn)物中提取的由11個氨基酸組成的中性環(huán)多肽。不溶于水，易溶于乙醇及多種溶劑，是一種新型強(qiáng)效免疫抑制劑。臨床上多用于器官移植術(shù)后，在眼科領(lǐng)域多用于角膜移植術(shù)后以及多種與免疫有關(guān)的疾病。近年來的研究表明，CsA對多種細(xì)胞表現(xiàn)出生長抑制作用，在適當(dāng)?shù)臐舛饶苡行У匾种蒲軆?nèi)皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞及表皮角質(zhì)

5、細(xì)胞、結(jié)膜下成纖維細(xì)胞及晶狀體上皮細(xì)胞的增生。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察CsA對體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelium，hRPE)細(xì)胞增生作用的影響，從而探討一種玻璃體視網(wǎng)膜增生性疾病的藥物治療方法。 材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)RPE細(xì)胞取自角膜移植的供體眼(供體為意外死亡的健康成人)，于供體死亡后12h內(nèi)分離培養(yǎng)：無菌條件下，將眼球置于眼杯之上，角膜緣后6mm環(huán)形剪開鞏膜，并去處眼前段及玻璃體，同

6、時神經(jīng)視網(wǎng)膜層隨之分離，僅與視盤處附著，自視盤處分離并剪除神經(jīng)視網(wǎng)膜層，暴露RPE層。PBS液沖洗3次，0.25％胰酶(或等量的0.25％胰酶和0.02％EDTA混合液)滴入眼杯中(注意不要溢出眼杯，以免消化鞏膜)，于培養(yǎng)箱中37℃下消化40～60分鐘后，取出眼杯，棄除消化液。加入胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)濃度為20％的DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化，并輕輕剝離出RPE層，制成懸液于離心管中，1000rpm8分鐘后

7、棄上清，再加入含20％FBS的DMEM，吹打成懸液，接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱(5％CO2、95％空氣、濕度為90％、溫度為37℃)中孵呼育。4～5天更換培養(yǎng)液，直至細(xì)胞融合傳代。選第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，采用鏈霉親合素-生物素化過氧化物酶復(fù)合物(sABC)法，一抗為鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 取2～3代RPE細(xì)胞以4～5×104/L接種入96孔培養(yǎng)板中(每孔200μL)，孵育24h貼

8、壁后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組單純用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組按所加CsA濃度的不同分為0.20μg/mL，0.40μg/mL,0.80μg/mL，1.60μg/mL，3.2μg/mL，6.4μg/mL。時間效應(yīng)關(guān)系分別于CsA作用24h、48h、72h測定，每個濃度復(fù)設(shè)3孔。 2.實(shí)驗(yàn)藥物環(huán)孢霉素A3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察人RPE細(xì)胞形態(tài)，并照相記錄。4.體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)-

9、四唑鹽比色法(MTT)取2～3代細(xì)胞以4～5×106/L接種于96孔板中，每孔200μL，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組同前作用濃度、時間及孔數(shù)。對照組用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。各實(shí)驗(yàn)組處理結(jié)束后，吸出上清液，再加5g/L的MTT20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h棄上清，加入DMSO150μL，吸出上清液，10min后于酶標(biāo)儀490nm波長下測吸光度A值。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±S)表示，數(shù)據(jù)

10、采用方差分析，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD方法，統(tǒng)計(jì)工作由SPSS10.0軟件完成。 結(jié)果1.hRPE細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定：原代培養(yǎng)的細(xì)胞附壁后呈圓形，或扁平多角形，胞漿內(nèi)富含黑色素顆粒，胞核圓形，透明。2～3周時鋪滿，此時細(xì)胞成致密排列的六角形。傳代2～3次后黑色素顆粒顯著減少或消失，細(xì)胞呈梭形及不規(guī)則形。傳代細(xì)胞鋪滿約需3～5天。細(xì)胞角蛋白免疫化學(xué)染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞胞漿內(nèi)呈特異棕黃色染色，并可見典型的角蛋白中間絲網(wǎng)架。

11、2.CsA對hRPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響：倒置顯微鏡下觀察，對照組細(xì)胞貼壁生長，排列均勻，細(xì)胞成梭形，色素顆粒少見。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞散在分布，細(xì)胞密度明顯減少，梭形變?yōu)閳A形，細(xì)胞體積縮小。 3.MTT比色法結(jié)果：不同濃度的CSA作用血清組人RPE細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞生長可受到不同程度的抑制，不同作用時間各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間吸光度比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的藥物劑量分別為：24h為0.40μg/mL有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；48h為0.40μg/mL有統(tǒng)計(jì)