全反式視黃酸對(duì)兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響.pdf

1、背景與目的：近視眼是眼科的常見病、多發(fā)病,影響患者的工作、學(xué)習(xí)和生活,發(fā)病率逐年上升,已成為全球性社會(huì)問題。對(duì)于近視的研究已有200多年的歷史,但其發(fā)病機(jī)制尚無定論。因此,闡明近視的發(fā)病機(jī)制日益成為生命科學(xué)領(lǐng)域急需解決的一大難題。20世紀(jì)后30年內(nèi)近視的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究取得了巨大進(jìn)展,確立了兩種近視的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?即:形覺剝奪性近視(form deprivation myopia,FDM),指用縫合眼瞼或戴彌散鏡片嚴(yán)重破壞動(dòng)物的形體覺所引起

2、的近視。離焦性近視(defocus myopia),指強(qiáng)迫動(dòng)物視近或戴負(fù)球鏡片使物體聚焦于視網(wǎng)膜后方,從而引起調(diào)節(jié)和眼軸延長,以致造成近視。自建立動(dòng)物近視模型以來,人們對(duì)近視的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有了更深入的研究。研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)近視發(fā)生的物質(zhì)主要來自視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮。視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮產(chǎn)生的一級(jí)信使首先作用于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞和葡萄膜細(xì)胞,使之產(chǎn)生的下一級(jí)生化物質(zhì)(稱為二級(jí)信使),再

3、作用于鞏膜,調(diào)控鞏膜生長,導(dǎo)致鞏膜重塑,眼軸延長。一些自分泌或旁分泌環(huán)路涉及的細(xì)胞因子、生長因子及其酪氨酸激酶受體可能對(duì)RPE細(xì)胞的病理改變起重要作用。全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的衍生物,能有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和發(fā)育。ATRA具有致畸性,并且是眼球發(fā)育的重要因子。研究表明,ATRA對(duì)于視網(wǎng)膜、鞏膜的發(fā)育及特定細(xì)胞類型(如感受器細(xì)胞、無長突細(xì)胞)的分化和成熟具有重要的影響。已知視網(wǎng)膜內(nèi)

4、層的無長突細(xì)胞參與了ATRA的代謝,而視網(wǎng)膜無長突細(xì)胞位于視網(wǎng)膜圖像加工過程的輸出端,這種加工過程的輸出與視覺控制眼球生長有關(guān)。近年來研究表明,ATRA對(duì)RPE細(xì)胞的增生有抑制作用,類似近視眼病理改變。在已知的近視信使中bFGF與TGF-β近年來研究較為深入,然而能影響眼球生長的肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowth factor,HGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)

5、則研究較少。本研究擬建立RPE細(xì)胞近視模型,從細(xì)胞的微觀角度來定性定量觀察ATRA在體外誘導(dǎo)RPE細(xì)胞在近視改變中的作用,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法測定RPE細(xì)胞內(nèi)HGF、MMP-2的表達(dá),用ELISA法測定RPE細(xì)胞中HGF的分泌量,以探討ATRA抑制RPE細(xì)胞的機(jī)制,以及在此作用下近視相關(guān)因子HGF、MMP-2的變化情況及關(guān)系。
　　材料與方法：1.選取健康1周齡黑色家兔12只,麻醉后在無菌條件下取雙眼球,距角膜緣后2mm環(huán)形剪開并去

6、除眼前段組織及玻璃體,將眼后段制成眼杯并固定,用0.25％Trypsin+0.02％EDTA約2ml室溫消化3min,吸出消化下來的神經(jīng)上皮層,再加入胰蛋白酶于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱消化15min,加入含F(xiàn)BS的DMEM終止消化,吸管輕輕吹打使RPE細(xì)胞脫落,收集細(xì)胞懸液于離心管中離心5min,加入含20％FBS的DMEM接種于培養(yǎng)瓶中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。以此法傳代至第3-5代可用于實(shí)驗(yàn)研究。2.應(yīng)用波形蛋白和角蛋白多克隆抗體

7、,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定RPE細(xì)胞。3.在RPE細(xì)胞生長的不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h),加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA,應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)測定ATRA作用后的RPE細(xì)胞生存率。4.在RPE細(xì)胞生長的不同時(shí)間點(diǎn),加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml濃度的ATRA,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法測定RPE細(xì)胞內(nèi)近視相關(guān)因子HGF、MMP-2的表達(dá)。5.在RPE細(xì)胞生長的不同時(shí)間點(diǎn),加入5nM/ml、1

8、0nM/ml、20nM/ml濃度的ATRA,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定RPE細(xì)胞中HGF分泌量。6.采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,測試指標(biāo)數(shù)據(jù)用(?)±s表示,不同濃度ARTA組在各處理時(shí)間點(diǎn)的RPE細(xì)胞活力比較采用x2檢驗(yàn)。對(duì)不同時(shí)間和不同ARTA濃度組的RPE細(xì)胞分泌HGF量的比較采用兩因素方差分析,各時(shí)間點(diǎn)間和各濃度組間的多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.成功建立RPE細(xì)

9、胞培養(yǎng)模型,觀察正常RPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:RPE細(xì)胞呈橢圓形或不規(guī)則多角形,?？煽吹桨咨该鞯陌撕巳?細(xì)胞質(zhì)內(nèi)布滿豐富的黑色素顆粒,環(huán)繞細(xì)胞核以同心圓狀分布。2.ATRA作用后RPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA均能抑制RPE細(xì)胞的增生,細(xì)胞增大扁平,突起減少,色素彌散。不同濃度的ATRA作用24h、48h、72h后RPE細(xì)胞均有增大扁平,突起減少,部分裂解,活力減弱的表現(xiàn)。3.臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)提

10、示:5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA作用24h后細(xì)胞存活率分別為99.50％、91.67％和87.44％(x2=10.80,P=0.002);48h后細(xì)胞存活率分別為99.02％、88.17％和80.44％(x2=18.59,P<0.001);72h后細(xì)胞存活率分別為98.44％、86.94％和71.08％(x2=29.46,P<0.001)。4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測HGF和MMP-2的表達(dá)提示:RPE細(xì)胞中HG

11、F、MMP-2的陽性表達(dá)位于RPE細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,陽性表達(dá)隨ATRA的濃度增高而增加,隨ATRA作用時(shí)間延長亦增加。在相同濃度和作用時(shí)間HGF的陽性表達(dá)比MMP-2的陽性表達(dá)更明顯。5.ELISA檢測HGF分泌量提示:RPE細(xì)胞分泌HGF的量隨ATRA的濃度增高而增加,任意兩組比較均有P<0.05。ARTA作用時(shí)間長短對(duì)RPE細(xì)胞分泌HGF的量影響不大,任意兩組比較均有P>0.05。
　　結(jié)論：1.ATRA的濃度≥5 nmol/m