全反式視黃醛對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的毒性作用機(jī)制及新穎視網(wǎng)膜脂褐質(zhì)色素iisoA2E的研究.pdf

1、年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的致盲性眼病。大量的研究證明:由于視網(wǎng)膜中全反式視黃醛（all-trans-retinal，atRAL）清除代謝障礙或急性過量光暴露而導(dǎo)致atRAL在視網(wǎng)膜中的過量累積可能是視網(wǎng)膜黃斑變性的關(guān)鍵原因之一。atRAL對視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，因而本課題選擇對維持視網(wǎng)膜正常生理功能非常重要的視網(wǎng)膜色

2、素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞，在體外水平上研究了atRAL對該細(xì)胞的毒性損傷的機(jī)制，并初步探索了RPE細(xì)胞對atRAL的代謝消除方式。AMD病人眼底累積有大量的脂褐質(zhì)色素成分----類似色素二聚體(bisretinoids)，而人們對這些色素成分在AMD發(fā)病中所起到的作用目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識。大量的研究證實(shí)類視色素二聚體產(chǎn)物具有一定的生物活性，因而其在視網(wǎng)膜中的過量積聚可能會一定程度促進(jìn)視網(wǎng)膜變

3、性的進(jìn)展。視網(wǎng)膜中脂褐質(zhì)色素的組成極其復(fù)雜，對這些成分的結(jié)構(gòu)解析、活性研究與其生物合成通路的確定有助于我們增加對其存在意義及atRAL在視網(wǎng)膜中代謝的認(rèn)識。因而本論文最后一部分對視網(wǎng)膜中一個新穎的atRAL代謝成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析和活性研究。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)了全反式視黃醛誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡。過度累積的內(nèi)源性atRAL會導(dǎo)致RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞的大量凋亡，這被認(rèn)為在AMD和青少年型視網(wǎng)膜黃斑變性疾病

4、Stargardt病的發(fā)病中起到一定的作用。在本章中，我們發(fā)現(xiàn)人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19能夠耐受低濃度的atRAL,但是較高濃度的atRAL對RPE細(xì)胞表現(xiàn)出損傷作用，引起細(xì)胞大量凋亡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，atRAL的處理使RPE細(xì)胞中活性氧(ROS)顯著升高，并上調(diào)Nrf2，HO-1和γ-GCSh的表達(dá)，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的ROS大量定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。atRAL上調(diào)了BiP的蛋白表達(dá)水平，并能濃度依賴性上

5、調(diào)ATF4、CHOP和GADD34的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，atRAL引起了RPE細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活了PERK-eIF2α-ATF4通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal能夠一定程度緩解atRAL所致RPE細(xì)胞死亡，且抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)能有效抑制RPE細(xì)胞死亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活。最后，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)atRAL處理后，RPE細(xì)胞的線粒體膜電位明顯降低，激活了caspase3和PARP。綜上，我們發(fā)現(xiàn)過度累

6、積的atRAL可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS并激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加重了RPE細(xì)胞的線粒體功能障礙，最終促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。
　　⑵視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對全反式視黃醛的代謝及全反式視黃醛二聚體形成意義的探索。在神經(jīng)視網(wǎng)膜層過度積聚的atRAL最終會進(jìn)入RPE層，從而能夠?qū)PE細(xì)胞造成顯著影響。在本章中，我們發(fā)現(xiàn)避光條件下RPE細(xì)胞和atRAL孵育后，atRAL可以被代謝為全反式視黃醇（all-trans-retinol

7、，atROL）和全反式視黃醛二聚體（all-trans-retinal dimer，atRAL-dimer）、A2E及其異構(gòu)體等產(chǎn)物，其中atRAL-dimer的量顯著高于A2E的量。同野生型小鼠相比，A2E及其異構(gòu)體、atRAL-dimer的累積量在RDH8-/-A BCA4-/-小鼠眼球中顯著升高，但atRAL-dimer的累積量及升高幅度均顯著高于A2E及其異構(gòu)體。我們發(fā)現(xiàn)同等條件下atRAL-dimer對RPE細(xì)胞活力、細(xì)胞線粒

8、體的膜電位的抑制作用顯著低于atRAL，其誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧產(chǎn)生及氧化應(yīng)激的相關(guān)基因Nrf2，HO-1和γ-GCSh表達(dá)的能力顯著弱于atRAL。綜上，我們發(fā)現(xiàn)在RPE細(xì)胞中的代謝atRAL途徑包括還原為atROL通路和以atRAL-dimer為代表的類視色素二聚體生成通路;體內(nèi)外的結(jié)果均表明，atRAL過量時易于在細(xì)胞內(nèi)累積atRAL-dimer; atRAL轉(zhuǎn)變?yōu)閍tRAL-dimer后，毒性顯著降低，因此atRAL-dimer的生成參

9、與緩解atRAL對RPE細(xì)胞的毒性損傷。
　?、切路f視網(wǎng)膜脂褐質(zhì)色素成分iisoA2E的發(fā)現(xiàn)及其對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響。大量的研究表明，在RPE細(xì)胞中過度累積的脂褐質(zhì)成分與AMD及Stargardt病的發(fā)生可能存在一定的關(guān)聯(lián)。RPE脂褐質(zhì)中存在大量的具有自發(fā)熒光特性的類視色素二聚體成分，該類成分在視網(wǎng)膜變性中的作用尚需進(jìn)一步闡明。在本章，我們從視網(wǎng)膜中分離鑒定出一個新穎的脂褐質(zhì)色素成分iisoA2E。我們檢測到iisoA2E廣

10、泛存在于小鼠、牛、豬及人的眼球或RPE/脈絡(luò)膜組織有機(jī)溶劑提取物中。在體外利用atRAL和乙醇胺反應(yīng)能夠制得iisoA2E，使得我們能夠得到足夠的高純度iisoA2E進(jìn)行分析。通過一維及二維核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜方法，我們最終確定出了iisoA2E的結(jié)構(gòu)。同A2E及isoA2E的結(jié)構(gòu)的相同點(diǎn)的是iisoA2E也擁有一個吡啶環(huán)和兩個多烯側(cè)臂，但其兩個多烯側(cè)鏈位于吡啶環(huán)的兩個相鄰碳原子上，這一點(diǎn)與A2E及isoA2E存在較大的差異。iisoA2

11、E是isoA2E的光異構(gòu)體，因而被命名為iisoA2E，但該異構(gòu)體不能直接由A2E的光異構(gòu)化形成。高效液相色譜及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)iisoA2E的光氧化活性顯著低于A2E和isoA2E。iisoA2E最大吸收值為430和352 nm，擁有自發(fā)熒光。體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)iisoA2E能濃度依賴性抑制RPE細(xì)胞的活力;較高濃度的iisoA2E能破壞細(xì)胞膜的完整性增加LDH的釋放，造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。使用磷脂酶D對A2PE系列產(chǎn)物進(jìn)行處理后，我們檢測到了除