MHC Ⅱ類反式激活蛋白啟動(dòng)子IV（CIITApIV）對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞因其獨(dú)特的解剖、生理功能在眼后段特別是維護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞功能等方面有其重要的作用,同時(shí)RPE細(xì)胞獨(dú)特的免疫功能因素對(duì)于維持視網(wǎng)膜功能的穩(wěn)定、損傷反應(yīng)和損傷后康復(fù)也有及其重要的作用.方法:1.人RPE細(xì)胞的培養(yǎng)、純化和觀察參照王雨生方法,對(duì)5只意外傷亡的尸供眼眼,12h內(nèi)進(jìn)行移去眼前段組織,制作眼杯,混合酶消化法分離RPE細(xì)胞,Fico11密度梯度分離

2、純化原代RPE細(xì)胞,酶消化同時(shí)處理人羊膜,RPE細(xì)胞接種到羊膜介質(zhì),進(jìn)行模擬組織原原位的RPE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察;用FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG,抗HLA-DR單抗,PE標(biāo)記或未標(biāo)記的抗人FasL單抗,PE標(biāo)記的抗人Fas單抗,進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記,通過FCM和激光共聚焦顯微鏡,觀察FasL、Fas以及MHC class Ⅱ分子表達(dá)的水平及其相關(guān)性.2.制作正常眼組織以及PVR膜石蠟標(biāo)本,進(jìn)行三種免疫相關(guān)分子的免疫熒光染色,通過FCM或激光共

3、聚焦顯微鏡觀察三種分子的表達(dá).3.通過經(jīng)鞏膜熱凝、810nm激光經(jīng)瞳孔溫?zé)嶂委?TTT)、532nm激光視網(wǎng)膜光凝等方法建立兔RPE損傷模型,不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)術(shù)眼進(jìn)行眼底彩色照相、ERG、OCT、FA/ICGA等臨床觀察,對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兔眼后段組織進(jìn)行組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和免疫熒光組織化學(xué)觀察.4.設(shè)計(jì)CIITA啟動(dòng)子Ⅲ、Ⅳ和CIITA特異引物,通過RT-PCR,確定經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)刺激下RPE細(xì)胞特異的CIITA啟動(dòng)子,通過CsA和FK50

4、6的抑制作用,觀察RPE細(xì)胞CIITA的抑制表達(dá)以及三種免疫相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性.結(jié)論:1.多種酶混合作用,消化分離原代RPE細(xì)胞,能較好地保存RPE細(xì)胞活性,有效形成RPE細(xì)胞單細(xì)胞懸液,細(xì)胞貼壁率和初步克隆形成率較單純胰酶或聯(lián)合EDTA消化結(jié)果高,密度梯度離心和不同速度離心結(jié)合方法純化原代RPE細(xì)胞效果滿意.國內(nèi)文獻(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道.2.在IFN-gamma刺激下,RPE細(xì)胞在可誘導(dǎo)表達(dá)MHC clas s Ⅱ分子的同時(shí),存在FasL的

5、下調(diào)表達(dá),而Fas表達(dá)沒有明顯改變.CsA和FK506分別抑制了部分MHC clas s Ⅱ分子的表達(dá),抑制效果存在一定范圍的時(shí)間和劑量的依賴性,聯(lián)合用藥未見明顯的最大抑制效果出現(xiàn).對(duì)于RPE細(xì)胞FasL的下調(diào)表達(dá)在國內(nèi)外是首次報(bào)道.3.利用臨床常見治療措施分別制作兔RPE損傷模型,分別觀察到在血-視網(wǎng)膜外屏障破壞后,RPE細(xì)胞存在MHCⅡ類分子的可誘導(dǎo)表達(dá),以及FasL表達(dá)的改變,并且觀察到經(jīng)鞏膜熱凝誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管形成.對(duì)于活體R