內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)房顫伴發(fā)的細(xì)胞凋亡和膠原代謝紊亂的生物學(xué)作用及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景：心房顫動(dòng)（簡(jiǎn)稱房顫）是一類臨床常見(jiàn)的心律失常性疾病，影響了至少420萬(wàn)中國(guó)人的健康。由于人口老齡化及醫(yī)療水平的提高，房顫的患病率在未來(lái)的20年預(yù)期會(huì)增加一倍。房顫帶來(lái)的巨大醫(yī)療財(cái)政負(fù)擔(dān)、增高的人群死亡率以及以腦卒中、心力衰竭為主的致死性臨床事件要求我們進(jìn)一步完善對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。然而房顫模型建立所需的設(shè)備和技術(shù)要求使得相關(guān)研究的廣泛開(kāi)展受到限制，因而我們對(duì)房顫病理過(guò)程中相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)相對(duì)滯后。既往的臨床研究表明房顫患者

2、心房肌出現(xiàn)加劇的細(xì)胞凋亡和組織纖維化，且其嚴(yán)重程度和房顫的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸成正相關(guān)，提示細(xì)胞凋亡和纖維化是房顫藥物治療的潛在靶點(diǎn)，與抗心律失常藥物聯(lián)用可以增強(qiáng)療效、減輕毒副作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ER stress)是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)。在炎癥、缺氧等不良環(huán)境下，ER stress可以通過(guò)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)促進(jìn)細(xì)胞生存;

3、當(dāng)刺激因子持續(xù)存在，ER stress過(guò)度激活，ER stress相關(guān)的凋亡通路將會(huì)啟動(dòng)以清除功能受損的細(xì)胞，同時(shí)造成組織損傷。ER stress凋亡通路涉及的調(diào)控因子眾多，如鈣離子、蛋白酶、激酶、轉(zhuǎn)錄因子、自噬等，它們彼此間的調(diào)控關(guān)系被充分認(rèn)識(shí)的卻很少。尤其是針對(duì)房顫病程中ER stress對(duì)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用及具體機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。除了對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯及細(xì)胞凋亡的調(diào)控外，近年來(lái)科研人員還發(fā)現(xiàn)ER stress似與膠原沉積、纖維

4、化形成也有著一定關(guān)聯(lián)。Baek HA報(bào)道轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(Transforming growth factor-beta2，TGF-β2)可以誘導(dǎo)ER stress發(fā)生，同時(shí)伴成纖維細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)增多，預(yù)示著成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。而在同時(shí)給予ER stress抑制劑4-PBA后，TGF-β2對(duì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)作用被抑制。其中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的演變是組織纖維化形成的早期改變。綜上所述，ER stre

5、ss很可能是房顫患者心房肌細(xì)胞凋亡和心房組織纖維化的重要調(diào)控因子，是延緩心房器質(zhì)性病變的潛在靶點(diǎn)，然而其具體的生物學(xué)作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，還需要我們進(jìn)一步深入研究。
　　目的：⑴高頻電刺激小鼠心房來(lái)源的HL-1細(xì)胞系建立房顫的體外模型，驗(yàn)證其是否具有與房顫患者心房肌一致的電學(xué)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，為房顫的研究提供確實(shí)可靠的研究載體。⑵驗(yàn)證高頻電刺激后HL-細(xì)胞是否發(fā)生細(xì)胞凋亡和膠原代謝異常。⑶探索ER stress對(duì)高頻電刺激后HL-1細(xì)胞凋

6、亡及膠原代謝的生物學(xué)作用及調(diào)控機(jī)制，以期從分子生物學(xué)角度完善對(duì)房顫病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　方法：①將5ms脈寬，10V/cm電壓，且同時(shí)選擇4Hz與8Hz兩種頻率的高頻電刺激作用于HL-1細(xì)胞24 h。以膜片鉗技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、4Hz組及8Hz組的動(dòng)作電位時(shí)程，調(diào)定后續(xù)的刺激頻率參數(shù)。②利用膜片鉗、透射電鏡、激光共聚焦顯微鏡及Western Blot分別檢測(cè)HL-1細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(Action potential duratio

7、n，APD)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞內(nèi)游離鈣、離子通道和膠原等的蛋白表達(dá)，驗(yàn)證其是否具有與房顫時(shí)心房肌一致的電學(xué)和組織學(xué)改變。③HL-1細(xì)胞接受不同的藥物預(yù)處理，包括ER stress的抑制劑、線粒體凋亡通路(Mitochondria apoptotic pathway，MAP)的抑制劑和絲裂原活化的蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的抑制劑。利用CellCounting Kit、Hoe

8、chst和AnnexinⅤ/PI染色、JC-1染色和Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位和信號(hào)通路蛋白表達(dá)，以探索ERstress、MAP和MAPKs在高頻電刺激所致細(xì)胞凋亡中的生物學(xué)作用及三者間的交互調(diào)控機(jī)制。④HL-1細(xì)胞接受不同的藥物預(yù)處理，包括ER stress的抑制劑或激動(dòng)劑及鈣蛋白酶(Calpain)抑制劑，利用Western Blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白表達(dá)，以探索ER stress、Calpain

9、和TGF-β2通路在高頻電刺激所致的膠原代謝異常中生物學(xué)作用和相互調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴對(duì)照組、4Hz組和8Hz組的APD90分別是159.3±4.910ms、129.7±4.631ms和74.00±3.606ms。8Hz刺激頻率為房顫時(shí)的心房的顫動(dòng)頻率(350-600)，且造成更明顯的APD90下降，被選用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)的頻率參數(shù)。⑵高頻電刺激24 h引發(fā)HL-1細(xì)胞出現(xiàn)APD縮短，形態(tài)學(xué)改變（細(xì)胞膜完整性破壞，偽足形成、細(xì)胞核固

10、縮變形及細(xì)胞器腫脹），細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，快速激活的延遲性整流鉀通道、L型鈣通道和縫隙連接蛋白43蛋白表達(dá)下調(diào)，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)上調(diào)。⑶高頻電刺激24h誘導(dǎo)44.23±2.69％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)照組凋亡率僅為1.84±0.25％。在高頻電刺激2h前預(yù)先給予ER stress抑制劑降低細(xì)胞凋亡率至23.70±2.91％;預(yù)先給予MAP抑制劑降低細(xì)胞凋亡率至18.59±6.58％;預(yù)先給予MAPKs各成分的抑制劑，可以將凋亡率降至2

11、0％-25％不等。⑷高頻電刺激24 h破壞線粒體功能，降低線粒體膜電位，在高頻電刺激2h前預(yù)先給予ER stress和MAPKs的抑制劑可以不同程度緩解高頻電刺激引發(fā)的線粒體膜電位降低。⑸高頻電刺激24h上調(diào)ER stress、MAP和MAPKs的蛋白表達(dá)，在高頻電刺激2h前預(yù)先給予ER stress抑制劑可以一定程度的緩解高頻電刺激造成的MAP和MAPKs激活。⑹高頻電刺激24 h上調(diào)膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶、TGF-β2通路和Calpa

12、in的蛋白表達(dá)。在高頻電刺激2h前預(yù)先給予ER stress或Calpain抑制劑可以一定程度的緩解高頻電刺激導(dǎo)致的膠原代謝異常。⑺ER stress的激動(dòng)劑可以上調(diào)Calpain、膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶和TGF-β2通路的蛋白表達(dá)。而抑制Calpain功能后，ER stress激動(dòng)劑造成的膠原代謝紊亂被糾正。
　　結(jié)論：①高頻電刺激后的HL-1細(xì)胞是房顫確實(shí)可靠的體外模型。②高頻電刺激誘導(dǎo)HL-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和膠原代謝紊亂。③