PSMD4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌是當(dāng)前危害人類健康的惡性腫瘤之一，具有很高的發(fā)病率與死亡率。由于肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期缺少有效的診斷方法，多數(shù)病人被診斷出肝癌時(shí)已屬于中晚期，錯(cuò)過最佳的治療機(jī)會(huì)。由于肝癌患者術(shù)后有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率而導(dǎo)致病人預(yù)后較差;同時(shí)，對(duì)于晚期不適合手術(shù)的肝癌患者，僅有索拉菲尼一種藥物目前在臨床使用，且治療效果有限。因此，深入理解肝癌的發(fā)病過程與分子機(jī)制，針對(duì)肝癌患者實(shí)施個(gè)體化精準(zhǔn)治療，提高生存顯得尤為重要。
　

2、　細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)主要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的組裝、加工以及鈣離子儲(chǔ)存。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。持續(xù)性的未折疊蛋白反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng)及下游分子的表達(dá)，而這些分子中就包括ATF4（activating transcription factor4）。ATF4作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折

3、疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路中的節(jié)點(diǎn)分子，能夠激活下游靶分子的表達(dá)，一方面促進(jìn)未折疊蛋白反應(yīng)的緩解，而在過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而在腫瘤細(xì)胞中，尤其是肝癌細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡時(shí)，ATF4具體受何分子和方式調(diào)控則鮮有相關(guān)報(bào)道。
　　PSMD4基因編碼的蛋白是26S蛋白酶體19S調(diào)節(jié)組分的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，又名RPN10，其結(jié)構(gòu)中含有泛素蛋白作用模序，與泛素化蛋白相互作用，介導(dǎo)泛素化蛋白質(zhì)的降解。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PSMD4基因的

4、缺失對(duì)酵母的存活并不構(gòu)成影響，而在高等生物中，PSMD4基因的缺失會(huì)影響其發(fā)育，如缺失PSMD4的小鼠胚胎在發(fā)育早期會(huì)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。PSMD4不僅在泛素化蛋白質(zhì)的降解調(diào)控中發(fā)揮作用，也參與高等生物的發(fā)育過程，但其功能與作用機(jī)制尚不明確。在某些疾病的病程中，PSMD4的作用及具體的分子機(jī)制尚待闡明。我們前期發(fā)現(xiàn)了PSMD4在肝癌中高表達(dá)，并且與肝癌的惡性程度有關(guān)，但結(jié)論基于的臨床肝癌樣本較少，同時(shí)對(duì)于PSMD4在肝癌細(xì)胞凋亡尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

5、激引起的凋亡中的作用及機(jī)制也少有探究。因此，在本研究中，我們通過擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究PSMD4在肝癌中的表達(dá)與病理、預(yù)后的關(guān)系，并借助肝癌細(xì)胞株、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型等研究PSMD4對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肝癌細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集肝癌樣本，構(gòu)建組織芯片并檢測(cè)PSMD4在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá);
　　2.整理分析肝癌樣本病理及預(yù)后資料，研究PSMD4在肝癌中的表達(dá)與肝癌病理、預(yù)后的關(guān)系及其臨床意義

6、;
　　3.利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑刺激、Western blot等技術(shù)，研究PSMD4對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響;
　　4.利用Western blot、免疫共沉淀等技術(shù)，研究PSMD4對(duì)ATF4的調(diào)控作用及其分子機(jī)制;
　　結(jié)果:
　　1.PSMD4組織芯片染色結(jié)果顯示肝癌組織中PSMD4的表達(dá)水平高于癌旁組織;
　　2.肝癌中PSMD4的表達(dá)與肝癌病人的預(yù)后有關(guān)，PMSD4可以作為潛在的肝癌預(yù)后判斷標(biāo)志物;

7、r>　　3.PSMD4能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡的敏感;
　　4.PSMD4通過caspase-8促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡敏感;
　　5.PSMD4不影響ATF4的轉(zhuǎn)錄，但能夠抑制其降解從而穩(wěn)定ATF4蛋白的表達(dá);
　　6.PSMD4能夠促進(jìn)ATF4在細(xì)胞核內(nèi)的聚集。
　　結(jié)論:
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)，在HCC病人的癌組織中，PSMD4的表達(dá)明顯高于癌旁組織，通過分析整理臨床肝癌病人樣本

8、的病理資料，發(fā)現(xiàn)PSMD4的高表達(dá)與臨床病理指標(biāo)具有相關(guān)性，進(jìn)一步通過生存分析發(fā)現(xiàn)PSMD4的表達(dá)與病人總體生存及復(fù)發(fā)有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PSMD4在肝癌中的表達(dá)可以作為獨(dú)立的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)因素，表明肝癌中PSMD4的表達(dá)水平具有臨床預(yù)后判斷價(jià)值。同時(shí)在細(xì)胞株研究中，我們還發(fā)現(xiàn)PSMD4能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡敏感，并且這一過程是通過促進(jìn)caspase8的活化完成的，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PSMD4引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡敏感性增加是通過抑