PSMD4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及作用的研究.pdf

1、目的:
　　肝細(xì)胞癌(hepatocellμlar carcinoma，HCC)是一種進(jìn)展速度很快的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死因中占第3位。盡管手術(shù)治療和肝移植是目前治療肝癌的第一選擇，但是也只適用于15％-25％的病人，絕大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前第二可行的治療方案還是化學(xué)療法，不幸的是由于化療所帶來的毒性導(dǎo)致治療效果并不理想。因此，探索研究新的基因功能改變與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展及其惡性特征的關(guān)系，對(duì)揭示其發(fā)生發(fā)展的分子

2、機(jī)制、設(shè)計(jì)合理的治療方案及判斷預(yù)后有重要的意義。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system)被認(rèn)為是一條重要的蛋白質(zhì)降解途徑，該系統(tǒng)在細(xì)胞周期，細(xì)胞分化與細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為中起重要的調(diào)節(jié)作用。26S蛋白酶體是該系統(tǒng)的主要組成部分，由2個(gè)19S和1個(gè)20S亞單位組成的桶狀結(jié)構(gòu)，20S為催化亞單位，19S為調(diào)節(jié)亞單位具有一種去泛素化的同功肽酶，使底物去泛素化而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解。PSMD4(Pro

3、teasome26S subunit，non.ATPase)基因編碼的蛋白是人26S蛋白酶體非ATP酶亞基4，內(nèi)在的子單元19S為調(diào)節(jié)亞單位可以綁定泛素而參與底物識(shí)別，從而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性降解。然而，PSMD4的表達(dá)與肝癌之間的關(guān)系尚不清楚。本研究的目的是利用臨床標(biāo)本和細(xì)胞模型，探測(cè)PSMD4在人類肝癌組織中的表達(dá)情況，以及對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響。從而為PSMD4是否可以代表一個(gè)有價(jià)值的肝癌標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　

4、方法:
　　通過Real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PSMD4在肝癌組織的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光染色分析檢測(cè)PSMD4的表達(dá)量;轉(zhuǎn)染靶向PSMD4的shRNA敲低內(nèi)源性PSMD4表達(dá);檢測(cè)KLF4蛋白表達(dá)MTT和集落形成分析PSMD4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;通過沉默表達(dá)PSMD4的細(xì)胞模型檢測(cè)其在體外的致瘤性。
　　結(jié)果:
　　1、抗體的測(cè)試及PSMD4在肝癌細(xì)胞內(nèi)的亞定位
　　首先我們構(gòu)建了兩種質(zhì)粒DNA，并

5、且通過質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后用western方法檢測(cè)到PSMD4蛋白都有不同程度的過表達(dá)，證明構(gòu)建的PSMD4質(zhì)粒很成功，也驗(yàn)證了PSMD4的抗體效能很好。然后我們用免疫熒光的方法檢測(cè)PSMD4的表達(dá)在細(xì)胞中的定位。PSMD4原始表達(dá)主要集中在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而過表達(dá)的PSMD4則主要集中在了細(xì)胞核中。
　　2、在臨床肝癌樣本中PSMD4的表達(dá)上調(diào)
　　為了檢測(cè)PSMD4在肝癌中的表達(dá)情況，同過Real-time PCR的方法，檢

6、測(cè)了PSMD4 mRNA的表達(dá)情況。按病理分期分成了四組，相對(duì)正常組，肝硬化組，高分化組和低分化組。結(jié)果顯示，PSMD4在肝癌組中的表達(dá)高于相對(duì)正常組和肝硬化組，而相對(duì)于正常組與肝硬化組，高分化組和低分化組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們進(jìn)一步檢測(cè)了PSMD4在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，Western結(jié)果顯示在隨即檢測(cè)的8組樣本中有75％肝癌樣本明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織。此外，免疫組化的結(jié)果顯示PSMD4在肝癌區(qū)域的表達(dá)高于旁邊的高分化或相對(duì)正常區(qū)域

7、。
　　3、過表達(dá)PSMD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞克隆的形成
　　為了深入研究PSMD4在肝癌中的生物學(xué)作用，通過Western的方法檢測(cè)了PSMD4在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果顯示，幾乎所有的肝癌細(xì)胞系中PSMD4都呈高表達(dá)的狀態(tài)。為進(jìn)一步探究過表達(dá)PSMD4是否調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們?cè)贖LK3中建立了PSMD4穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系和空載體對(duì)照組。然后檢測(cè)了PSMD4對(duì)克隆形成能力的影響。在HLK3細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染PSMD4質(zhì)粒和相

8、對(duì)照的空質(zhì)粒，經(jīng)過兩周的G418藥物的篩選，結(jié)果顯示，PSMD4組的克隆形成在數(shù)量及大小上明顯多于對(duì)照組，并且結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.05)。在SH-J1中的驗(yàn)證也得到了相同的結(jié)果。以上的結(jié)果表明，過表達(dá)PSMD4可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞克隆形成的能力。
　　4、沉默PSMD4抑制體外腫瘤的形成
　　通過構(gòu)建shRNA干擾PSMD4的慢病毒，并建立了干擾PSMD4及對(duì)照的肝癌細(xì)胞系(SK-Hep1和Huh7)。MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

9、了穩(wěn)定干擾PSMD4表達(dá)的SK-Hep1和Huh7兩個(gè)肝癌細(xì)胞系后，與對(duì)照細(xì)胞系相比，干擾組的細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制。進(jìn)一步檢測(cè)穩(wěn)定干擾PSMD4表達(dá)后對(duì)肝癌惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，在干擾PSMD4之后，克隆的形成能力明顯受到了抑制。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，干擾組細(xì)胞的體外成瘤形成能力受到了顯著的抑制。以上結(jié)果提示，PSMD4影響了肝癌細(xì)胞在體外的增殖和克隆形成的能力。
　　結(jié)論:
　　1、抗體的測(cè)試及PSMD4在