GP73參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的脂質(zhì)代謝紊亂的機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)的狀態(tài)。許多因素都可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，包括細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白增多、鈣代謝紊亂、缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、化學(xué)物質(zhì)處理、卵磷脂合成障礙等，其中未折疊蛋白增多是最常見也最重要的一種因素。未折疊蛋白增多能夠激活細(xì)胞啟動未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），UPR可以通過減少蛋白的合成、加速蛋白的降解、增強(qiáng)蛋白的折疊或者增加脂質(zhì)的合成來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)穩(wěn)

2、態(tài)。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂代謝異常類疾病的發(fā)生相關(guān)，如非酒精性脂肪肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD），然而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂代謝異常中所起的作用尚不清楚，但已經(jīng)明確的是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白質(zhì)（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。
　　SREBPs是一種重要的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)

3、節(jié)因子。正常情況下，沒有活性的前體SREBPs與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（ SREBP cleavage-activating protein，SCAP）結(jié)合，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)固醇含量減少時(shí)，SREBPs/SCAP復(fù)合體轉(zhuǎn)移至高爾基體，在高爾基體被site-1蛋白酶（S1P）與site-2金屬酶（S2P）切割后，它的活性端將釋放進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)脂質(zhì)合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)細(xì)胞中固醇水平較高時(shí)，胰島素誘導(dǎo)基因（insul

4、in induced gene proteins, Insig）則與SCAP/SREBPs發(fā)生相互作用，抑制SREBPs向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)及活性形式的形成。
　　高爾基體糖蛋白73（Golgi Protein73，GP73）又叫GOLM1（golgi membrane protein1）或者GOLPH2（golgi phosphoprotein2），是一種定位于高爾基體的Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73在人體正常肝組織的肝細(xì)胞中表達(dá)很少甚至

5、不表達(dá)，但近幾年發(fā)現(xiàn)在很多肝臟疾病中其表達(dá)上調(diào)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)GP73能夠誘發(fā)膽固醇相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而且GP73能與SCAP及SREBPs發(fā)生相互作用，推測GP73很有可能通過 SCAP/SREBPs促進(jìn)脂質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的SREBPs脂質(zhì)代謝通路。
　　在本研究中，通過體內(nèi)外模型的構(gòu)建以及相關(guān)指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn)：
　　1. GP73可以通過參與SCAP-SREBPs脂代謝通路調(diào)控脂質(zhì)代謝：我們在HepG

6、2細(xì)胞中利用IP、WB技術(shù)檢測了GP73與SCAP及SREBP1的相關(guān)性，免疫熒光檢測了SCAP在細(xì)胞內(nèi)的定位，qPCR技術(shù)檢測脂代謝相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)（1）GP73能夠與SCAP及SREBP1發(fā)生相互作用；（2）過表達(dá)GP73可以增強(qiáng)SCAP、SREBPs的表達(dá)；（3）GP73能夠促進(jìn)SCAP在高爾基體的定位以及SCAP與SREBPs的相互作用；（4）過表達(dá) GP73能上調(diào)脂代謝相關(guān)基因基因的表達(dá)，如 acety-CoA、FASN、H

7、MGCS1、HMGCS2、HMGR。
　　2. GP73在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-SCAP/SREBP1脂質(zhì)代謝通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用：我們用衣霉素（tunicamycin，Tm）、毒胡蘿卜素（Thapsigargin，Tg）、H2O2、CuSO4分別刺激細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對 GP73表達(dá)的影響；最后利用RNAi技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)GP73敲低，再檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后SCAP及SREBP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)（1）藥物刺激產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對GP7

8、3的表達(dá)有促進(jìn)作用；（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對SCAP及SREBP1的表達(dá)具有促進(jìn)作用；（3）在GP73敲低細(xì)胞內(nèi)，利用藥物激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，SCAP、SREBP1表達(dá)增加不顯著。
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 GP73對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響：用藥物 Tm以2mg/kg小鼠的用量進(jìn)行腹腔注射，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激動物模型，0、8、12、24h后，取小鼠血清及肝臟組織，檢測各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況。同時(shí)利用RNAi技術(shù)構(gòu)建GP73敲低小鼠，將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組及

9、對照組，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（1）肝臟中GP73同C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）表達(dá)水平變化一致，隨著藥物作用時(shí)間的延長肝臟中GP73同CHOP mRNA逐漸升高，24 h時(shí)表達(dá)最高；（2）藥物注射后隨著刺激時(shí)間的延長，血清中膽固醇（CH）、甘油三酯（TG）的含量逐漸降低，而肝臟中CH和TG的水平基本呈增高趨勢；（3）藥物Tm刺激后小鼠肝臟中的GP73蓄積增加；（4）在藥物Tm注射12

10、 h后，肝臟組織中GP73mRNA水平表達(dá)明顯增多，且膽固醇、甘油三酯及脂蛋白的水平急劇下降，然而在GP73敲低后可以緩解肝臟中脂質(zhì)的下降水平；小鼠血液中膽固醇、甘油三酯及脂蛋白的水平明顯升高，在GP73敲低小鼠中這種趨勢則被抑制；（5）GP73敲低的小鼠肝臟中，脂質(zhì)累積明顯少于對照組。
　　通過以上研究，我們首次發(fā)現(xiàn)了GP73通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝，并在固醇調(diào)節(jié)通路中扮演著重要作用。我們的研究證明GP73很有可能