RNAi剔降hTERT基因并誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文RNAi剔降hTERT基因并誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的研究姓名：吳斌華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：周克元20050501RNAi剔降hTERT基因并誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的研究中文摘要【目的】PNA干擾技術(shù)(RNA：interference，RNAi)是近年才發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基因調(diào)控技術(shù)。它能特異性地識(shí)別目標(biāo)基因，并阻抑其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。端粒酶的激活對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，而hTERT(human

2、telomerasereversetranscriptase)基因是端粒酶活性亞基。本文將采用以質(zhì)粒為載體的RNAi技術(shù)，剔降鼻咽癌CNE2Z細(xì)胞株hTERT基因，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?！痉椒ā拷柚W(wǎng)上RNAi設(shè)計(jì)工具尋找hTERT基因上開(kāi)放表達(dá)框架中3個(gè)可能的位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)BLAST檢查確定與其它基因不存在同源性。人工合成3對(duì)正反義脫氧寡核苷酸鏈，退火，定向克隆入含小鼠mU6啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pmU6中。PCR檢測(cè)和DNA測(cè)序

3、確定重組結(jié)果0抽提和純化已鑒定的質(zhì)粒，根據(jù)260nm紫外線吸收值及其與280nto紫外線吸收值的比值計(jì)算重組質(zhì)粒的濃度和純度。利用陽(yáng)離子TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將siRNA質(zhì)粒和熒光表達(dá)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至CNE2Z細(xì)胞中，通過(guò)觀察熒光蛋白在細(xì)胞中是否出現(xiàn)表達(dá)分析質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。以半定量RTPCR法篩選有效的靶序列，以Western—Blot和檢捌f端粒酶活性變化來(lái)檢驗(yàn)siRNA質(zhì)粒的RNAi效應(yīng)。再以MTT法檢