HSP70-2基因在鼻咽癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　本研究通過慢病毒技術(shù)上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞6-10B的HSP70-2基因的表達(dá)和異黃酮類藥物ZSGS-4下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞6-10B和5-8F的HSP70-2基因的表達(dá),探索HSP70-2基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞增殖的影響。
　　方法:
　　一方面應(yīng)用慢病毒技術(shù),構(gòu)建pLV-HSP70-2-IRES/eGFP-Neo目的慢病毒載體和pLV-CMV-eGFP-Neo空載慢病毒載體,分別獲得目的慢病毒和空載慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的6-10B細(xì)

2、胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,即6-10B-HSP70-2/eGFP細(xì)胞(目的基因組)和6-10B-blank/eGFP細(xì)胞(空載對照組),上調(diào)6-10B細(xì)胞HSP70-2基因表達(dá)。另一方面應(yīng)用黃酮類藥物ZSGS-4下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞6-10B和5-8F的HSP70-2基因表達(dá)。繼而應(yīng)用Western blotting檢測hsp70-2蛋白表達(dá)水平;CCK8檢測細(xì)胞生長曲線;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡狀況。
　　結(jié)果:
　　首先構(gòu)建了pEntry

3、221-HSP70-2-IRES/eGFP入門載體,再應(yīng)用 LR反應(yīng)構(gòu)建了pLV-HSP70-2-IRES/eGFP-Neo目的慢病毒載體和pLV-CMV-eGFP-Neo空載慢病毒載體,再運(yùn)用慢病毒4質(zhì)粒包裝系統(tǒng)成功包裝出目的慢病毒和空載慢病毒,分別轉(zhuǎn)導(dǎo)6-10B細(xì)胞后經(jīng)G418篩選出各自的單克隆細(xì)胞,利用Western blotting方法檢測各組細(xì)胞hsp70-2蛋白表達(dá)水平,即6-10B-HSP70-2/eGFP細(xì)胞組與6-10

4、B-blank/eGFP細(xì)胞組或與6-10B細(xì)胞組比較,hsp70-2蛋白表達(dá)量升高75.31±3.54％(P<0.01)或75.13±3.36%(P<0.01),驗(yàn)證了6-10B-HSP70-2/eGFP和6-10B-blank/eGFP細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。6-10B-HSP70-2/eGFP細(xì)胞、6-10B-blank/eGFP細(xì)胞和6-10B細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h和72h后,6-10B-HSP70-2/eGFP細(xì)胞與6-10B-bla

5、nk/eGFP細(xì)胞比較,細(xì)胞增殖率分別升高29.18±0.014%(P<0.01)、81.72±0.124%(P<0.001)和41.84±0.004%(P<0.001);與6-10B細(xì)胞比較,細(xì)胞增殖率分別升高25.69±0.031%(P<0.01)、84.53±0.060%(P<0.001)和45.28±0.044%(P<0.001)。6-10B-HSP70-2/eGFP細(xì)胞、6-10B-blank/eGFP細(xì)胞和6-10B細(xì)胞分別

6、培養(yǎng)24h后,6-10B-HSP70-2/eGFP細(xì)胞與6-10B-blank/eGFP細(xì)胞比較,增殖指數(shù)(PI)和S期細(xì)胞比率(SPF)分別增加73.31±5.882%(P<0.001)和71.09±7.495%(P<0.01);與6-10B細(xì)胞比較,PI和SPF分別增加72.60±1.300%(P<0.001)和69.29±13.42%(P<0.01)。細(xì)胞凋亡百分比,各組間相比無明顯變化(P>0.05)。
　　另一方面,應(yīng)用

7、不同濃度的異黃酮類藥物ZSGS-4(0μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL、15μg/mL和17.5μg/mL)分別處理6-10B和5-8F細(xì)胞12h。各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,hsp70-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低(p<0.05);細(xì)胞抑制率明顯增強(qiáng)(p<0.05);G0/G1期和S期DNA含量明顯降低(p<0.05);subG0/G1期和G2/M期DNA含量明顯升高(p<0.05);細(xì)胞凋亡率明顯升高(p<0.05)。