RNAi沉默HSP70基因對宮頸癌HeLa細胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的：熱休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）在多種腫瘤中高表達，在宮頸癌中HSP70基因也是高表達的，表明該基因在癌變過程中起著重要的作用。研究表明，腫瘤細胞的不斷增殖，需要大量的HSPs作為“分子伴侶”來調節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖的過程，HSPs參與細胞周期調節(jié)、DNA損傷的修復，被認為與細胞周期，腫瘤的發(fā)生發(fā)展，腫瘤免疫以及機體對腫瘤治療耐受性的發(fā)生及腫瘤預后等密切相關。為進一步了解HSP70基因在宮頸癌

2、發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本文采用RNAi方法，制備針對HSP70基因的特異性siRNA序列，瞬時轉染宮頸癌HeLa細胞，觀察HSP70基因對宮頸癌HeLa細胞的增殖和凋亡的影響，闡明HSP70基因在宮頸癌HeLa細胞中的作用，為治療宮頸癌提供新的基因治療靶點。
　　 方法：1.針對HSP70基因設計siRNA序列，克隆到空載體pTZU6+1中，轉化DH5a菌株，擴增提取質粒，進行酶切鑒定和測序分析。2.在Lipofectamine

3、TM2000的介導下瞬時轉染宮頸癌HeLa細胞，轉染時細胞分為三組：第一組為實驗組，轉染重組體pHSP70-siRNA，第二組為陰性對照組，轉染空載體pTZU6+1，第三組為空白對照組，即不加轉染試劑也不加任何質粒。分別在轉染48h后，提取各組HeLa細胞總RNA和蛋白，采用RT-PCR、Western blot方法檢測轉染前后HeLa細胞中HSP70基因的表達情況，以鑒定該重組體的表達。3.在轉染24h、48h、72h，采用MTT方法

4、檢測細胞生長與增殖的變化。在轉染48h收集各組細胞，采用AO/EB雙染色法檢測各組細胞形態(tài)的變化，通過流式細胞術方法檢測重組體pHSP70-siRNA對宮頸癌HeLa細胞的凋亡率及細胞周期分布的影響。
　　 結果：1.pHSP70-siRNA經(jīng)酶切鑒定和測序分析，結果顯示重組體構建成功，并將其命名為pHSP70-siRNA。2.將重組體pHSP70-siRNA瞬時轉染宮頸癌HeLa細胞后，采用RT-PCR、1％瓊脂糖凝膠電泳可獲

5、得HSP70和內參GAPDH的2個條帶，實驗組中HSP70/GAPDH灰度比值為（0.35±0.03），而陰性對照組和空白對照組中HSP70/GAPDH的灰度比值分別為（0.76±0.05）、（0.66±0.07）。經(jīng)統(tǒng)計學分析表明，實驗組中HeLa細胞mRNA的表達相對量與陰性對照組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而空白對照組和陰性對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果表明：重組體pHSP70-siRNA瞬時轉染宮頸癌H

6、eLa細胞能特異性降低HSP70 mRNA在HeLa細胞中的表達。Western blot方法檢測實驗組、陰性對照組、空白對照組的HSP70/β-actin灰度比值分別為（2.46±0.39）、（4.68±0.32）、（4.57±0.22）。統(tǒng)計學分析表明：實驗組HeLa細胞的蛋白表達量與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而空白對照組和陰性對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。Western blot實驗結果表明轉

7、染重組體pHSP70-siRNA后的宮頸癌HeLa細胞中HSP70蛋白表達明顯下調。3.重組體pHSP70-siRNA瞬時轉染宮頸癌HeLa細胞，分別在24、48、72h，采用MTT法檢測各組細胞的吸光值，根據(jù)公式計算：抑制率（％）=[1-處理組OD（570）值/空白組OD（570）值]×100％，在24h，實驗組、陰性對照組、空白對照組的抑制率分別為10.35±0.42、4.11±0.16、3.58±0.31，在48h的抑制率分別為1

8、7.99±0.44、4.00±0.19、3.56±0.23，在72h的抑制率分別為15.97±0.61、3.97±0.16、3.63±0.33，結果顯示實驗組的細胞抑制率明顯高于陰性對照組（P<0.01），有統(tǒng)計學意義，且實驗組在48h時細胞抑制率達到最高，而空白對照組和陰性對照組之間差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。MTT實驗結果表明重組體pHSP70-siRNA對宮頸癌HeLa細胞的生長與增殖有明顯的抑制作用。AO/EB染色法結果

9、表明轉染重組體pHSP70-siRNA的宮頸癌HeLa細胞出現(xiàn)明顯的細胞凋亡形態(tài)，而陰性對照組和空白對照組的細胞形態(tài)變化不明顯。流式細胞術檢測各組細胞的周期分布，實驗組細胞G0/G1、S、G2/M期分別占（51.76±0.80）％、（42.16±0.64）％、（6.09±0.16）％，陰性對照組細胞G0/G1、S、G2/M期分別占（61.18±0.29）％、（36.76±0.21）％、（2.06±0.09）％，空白對照組細胞G0/G1、

10、S、G2/M期分別占（60.70±0.35）％、（37.44±0.65）％、（1.85±0.30）％，結果表明轉染重組體pHSP70-siRNA后，G2/M和S期細胞有所增加，G0/G1期細胞減少，說明重組體pHSP70-siRNA可能通過阻滯細胞有絲分裂，使細胞堆積在S期和G2/M期，從而阻止HeLa細胞周期的進展，抑制HeLa細胞的增殖。流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率，得到實驗組、陰性對照組、空白對照組的凋亡率分別為37.07±0.

11、75％、3.06±0.09％、3.04±0.07％，且從流式細胞圖上可見實驗組細胞有明顯的凋亡二倍體峰。
　　 結論：1.酶切鑒定和測序分析重組體證明pHSP70-siRNA構建成功。2.瞬時轉染重組體pHSP70-siRNA入宮頸癌HeLa細胞，①HSP70基因的表達能有效抑制。②宮頸癌HeLa細胞的生長與增殖受到抑制。③重組體pHSP70-siRNA使HeLa細胞堆積在S期和G2/M期，阻止細胞周期的進展，并出現(xiàn)凋亡二倍體峰