EB病毒EBER2變異型通過(guò)PKR抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的：EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）編碼小RNA（EBV-encoded RNAs，EBERs，包括EBER1和EBER2）的致癌作用已在多種細(xì)胞系中得到證實(shí)。我們前期對(duì)EBERs基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)在EBER2基因發(fā)生6處共有突變的EB-8m變異型可能與鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）尤其是高發(fā)區(qū)NPC的發(fā)生相關(guān)。以往有研究表明EBERs通過(guò)結(jié)合RNA激活蛋白激酶（RNA-

2、activated protein kinase，PKR）并抑制其磷酸化從而抵抗干擾素-α（Interferonα，IFN-α）誘導(dǎo)的凋亡。本研究旨在明確變異型EBER2對(duì)NPC細(xì)胞增殖和IFN-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，探討其對(duì)PKR結(jié)合和磷酸化以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為明確EBER2及其變異型參與NPC的分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：以只含EBER2基因的B95-8型和EB-8m變異型基因慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EBV陰性NPC細(xì)胞系

3、CNE1和HONE1為研究對(duì)象，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和IFN-α細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；Western blot檢測(cè)PKR、轉(zhuǎn)錄起始因子eIF2α和核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化蛋白表達(dá)水平及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)情況；PKR基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EBER2陽(yáng)性細(xì)胞后進(jìn)行RNA蛋白結(jié)合免疫共沉淀，采用Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2 RNA和PKR蛋白水平。
　　結(jié)果：⑴與轉(zhuǎn)染原型EBER2細(xì)

4、胞及轉(zhuǎn)染載體病毒（不含EBER2）的對(duì)照細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染變異型EBER2細(xì)胞MTT吸光度值和平板克隆形成率增高（P均小于0.05），原型和對(duì)照之間尚無(wú)差異。⑵轉(zhuǎn)染原型和變異型EBER2細(xì)胞的細(xì)胞存活率高于對(duì)照細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)低于對(duì)照細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05），且轉(zhuǎn)染變異型EBER2細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)亦低于轉(zhuǎn)染原型EBER2細(xì)胞，差異有顯著性（P<0.05)。⑶與轉(zhuǎn)染對(duì)照病毒細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染原型和變異型EBER2細(xì)胞中磷

5、酸化PKR、eIF2α和c-Jun表達(dá)下降，Bcl-2表達(dá)上調(diào)；轉(zhuǎn)染變異型EBER2細(xì)胞較轉(zhuǎn)染原型EBER2細(xì)胞磷酸化PKR表達(dá)下降更為明顯。⑷原型和變異型EBER2均可與PKR發(fā)生免疫共沉淀，且EB-8m變異型EBER2在免疫共沉淀產(chǎn)物中的富集倍數(shù)高于原型EBER2，差異有顯著性（P<0.05）。
　　結(jié)論：①EB-8m變異型EBER2可提高NPC細(xì)胞增殖及抗凋亡能力。②EBER2可通過(guò)結(jié)合PKR并抑制其發(fā)生磷酸化，同時(shí)抑制eI