EBNA1穩(wěn)定鼻咽癌細胞內(nèi)EB病毒基因組作用的初步探討.pdf

1、鼻咽癌是我國華南地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤，絕大部份為低分化或未分化型鱗癌，惡性度較高，生長快，易出現(xiàn)遠處淋巴結轉移，因而傳統(tǒng)的局部放射治療很難提高晚期鼻咽癌病人的生存率。 經(jīng)過多年的病理學研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有病人的未分化型鼻咽癌組織中均存在Epstein-Barr病毒(EBV)基因組，這種鼻咽癌細胞為EBV陽性的特征為鼻咽癌的基因治療提供了靶點。然而，目前國內(nèi)外已建立的鼻咽癌細胞系還沒有病毒潛伏感染并穩(wěn)定存在的細胞模型。因此，建立穩(wěn)

2、定感染EBV的鼻咽癌細胞株是打破研究瓶頸的重要前提。 目的：本研究通過探討EBV的轉錄因子EBNA1在維持病毒基因組穩(wěn)定中的作用，建立EBV穩(wěn)定感染的鼻咽癌細胞模型，從而為鼻咽癌的基因治療及臨床前研究奠定基礎。 方法：1.通過共培養(yǎng)法使CNE1或CNE2細胞感染EBV攜有EBV的B95-8細胞與CNE1或CNE2細胞接觸共培養(yǎng)24小時，使其感染EBV。 2.抗體激活補體依賴的細胞毒性實驗以去除B95-8細胞根據(jù)抗

3、體激活補體依賴的細胞毒性原理，采用抗IgM抗體和新鮮兔血清選擇性地去除共培養(yǎng)系中的B95-8細胞。 3.檢測B95-8細胞的去除效果，同時驗證CNEB細胞內(nèi)的EBV的存在以去除B95-8的感染后細胞的基因組DNA為模板，PCR擴增B95-8特異的CAJA-DRBI片斷，檢測是否徹底去除B95-8細胞。將感染后的CNE1、CNE2細胞分別命名為CNEB1、CNEB2。以CNEB1和CNEB2細胞的基因組DNA為模板擴增EBV的Ba

4、mHI-W基因，在基因組水平上檢測細胞中EBV的存在。通過RT-PCR及SouthernHybridize雜交的方法檢測CNEB2細胞中的EBV潛伏期的EBER和裂解期的BZLF-1的轉錄。 4.EBNA1真核表達載體的構建及WesternBlot檢測 PCR擴增EBV的EBNA1LR1和LR2-DNA結合區(qū)兩段功能片斷，先后連于真核表達載體pcDNA3.1/myc-his(+)C，完成EBNA1真核表達載體的構建，將其

5、命名為P-T-EBNA。將P-T-EBNA瞬時轉染293細胞，通過WesternBlot檢測EBNA1的表達。 5.P-T-EBNA穩(wěn)定EBV基因組的功能鑒定在感染后第九天的CNEB2細胞轉染P-T-EBNA及空載體，通過檢測EBER的轉錄持續(xù)期間，驗證P-T-EBNA具有穩(wěn)定EBV基因組于鼻咽癌細胞內(nèi)的功能。 結果：1.形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)CNEB1和CNEB2細胞形態(tài)有所改變，由多邊形變成梭形，一些細胞內(nèi)有許多空泡生成，貼

6、附能力明顯減弱。 2.對CNEB2細胞的CAJA-DRBI基因的檢測結果為陰性，證明抗體激活補體依賴的細胞毒性實驗能有效去除B95-8細胞。 3.在DNA水平檢測到了BamHI-W基因，證明CNEB2細胞內(nèi)存在EBV基因，在RNA水平檢測到BZLF-1轉錄持續(xù)12天，EBER轉錄持續(xù)14天。通過SouthernHybridize雜交的方法進一步驗證了BZLF-1的轉錄。 4.成功構建了EBNA1真核表達載體P-T

7、-EBNA，通過WesternBlot檢測到目的基因EBNA1可以在真核細胞中表達。 5.轉染P-T-EBNA的CNEB2細胞內(nèi)EBV基因持續(xù)時間明顯長于對照組。 結論：本研究通過建立EBV陽性的鼻咽癌細胞模型，主要得出以下結論： 1.鼻咽癌細胞與B95-8細胞接觸共培養(yǎng)的方法是鼻咽癌細胞感染EBV的有效途徑。 2.與CNE1相比CNE2的細胞內(nèi)環(huán)境更適合EBV的潛伏感染。 3.抗體激活補體依賴的