紫色LED光照射姜黃素對鼻咽癌細(xì)胞殺傷作用及機(jī)制的初步探討.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma)是一種好發(fā)于我國南部地區(qū)的惡性腫瘤，具有明顯的地域性，它的發(fā)生和地方飲食、環(huán)境、免疫以及病毒感染等多種因素有關(guān)。針對鼻咽癌的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，鼻咽癌的放療效果較好，但是復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移率較高。近些年采用了新的治療方法如生物干預(yù)、免疫調(diào)節(jié)以及中醫(yī)藥治療等綜合治療，光動力療法就是其中之一。
　　 光動力療法(photo dynamic therapy，PDT)是

2、一種新興的治療腫瘤的手段，它的作用原理是利用光敏劑可以特定地聚集在腫瘤組織，而且在一定波長的光的激發(fā)下，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)和能量轉(zhuǎn)移，氧存在的條件下可以生成大量的活性氧基團(tuán)(reactive oxygen species，ROS)，損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死，從而達(dá)到治療腫瘤的作用。由于光敏劑和腫瘤的親和力高，因此PDT治療具有一定的特異性，對周邊正常組織的損傷較小。但是畢竟屬于局部治療，治療范圍有限，采用的光源主要是大型

3、的激光器，而且光敏劑價(jià)格昂貴，同時(shí)還會對人體產(chǎn)生一定的光毒性，給人們的生活帶來不便?；谝陨戏N種原因，研究人員開始從光源，光敏劑，聯(lián)合作用三方面進(jìn)行光動力療法的改進(jìn)研究。
　　 傳統(tǒng)的化療藥物雖然有較顯著的抗腫瘤效應(yīng)但同時(shí)也會對機(jī)體產(chǎn)生一定的副反應(yīng)，現(xiàn)在很多研究人員致力于從植物中提取低毒的抗腫瘤藥物，姜黃素就是其一。姜黃素是從姜黃的根莖中提取的一種植物多酚，具有顯著的抗炎、抗氧化以及抗腫瘤效應(yīng)，并且毒副作用少。姜黃素除了具有抗腫

4、瘤效應(yīng)外還具有光敏化效應(yīng)，在光照的情況下容易發(fā)生變構(gòu)和分解，其可見光的激發(fā)波長為425nm。有極少數(shù)研究證實(shí)酚類物質(zhì)經(jīng)日光照射后可以發(fā)揮較強(qiáng)的抗癌作用，但研究的還不深入。基于姜黃素光敏化特性和目前的研究現(xiàn)狀，將姜黃素作為光敏劑用于PDT治療中，既有可能發(fā)揮姜黃素本身的抗癌效應(yīng)同時(shí)發(fā)揮其光敏化效應(yīng)，可避免傳統(tǒng)光敏劑的一些毒副作用。本課題擬采用紫色LED光作為激發(fā)光，觀察其照射姜黃素對兩種鼻咽癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，并初步探討紫色LED光照射姜黃

5、素抑制鼻咽癌細(xì)胞生長的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)采用兩種鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2，分為對照組、單獨(dú)姜黃素孵育2h組(姜黃素濃度為5、10、20、40、80和160μM)和紫色LED光照射姜黃素組(采用的光能量密度分別為0.1、0.2、0.4和0.6J/cm2)。MTT檢測各組處理24h后對兩種細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。然后用能量密度為0.2J/cm2的紫色LED光照射40μM姜黃素，采用HE染色光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變

6、化；接著采用Hoechst33342染色熒光顯微鏡定性觀察和PI流式細(xì)胞儀定量檢測在不同處理后24h鼻咽癌細(xì)胞的凋亡情況，同時(shí)檢測各處理組細(xì)胞的周期分布。隨后利用DCFH-DA探針標(biāo)記細(xì)胞，檢測40μM姜黃素處理后不同時(shí)間點(diǎn)鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成變化(時(shí)間點(diǎn)為30、60和120min)；并檢測不同能量密度的紫色LED光照射姜黃素后(姜黃素孵育2h)對鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)量的影響。最后加入不同的活性氧抑制劑(NAC、疊氮鈉和甘露醇)檢測

7、鼻咽癌細(xì)胞活性的改變。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.單獨(dú)姜黃素作用后CNE1和CNE2的IC50值分別為164.11μM和190.97μM；經(jīng)0.2J/cm2紫色LED光照射后對鼻咽癌處理，IC50值分別為47.7μM和55.6μM。采用40μM的姜黃素孵育經(jīng)0.1、0.2、0.4和0.6J/cm2紫色LED

8、光照射后對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)會隨著紫光能量密度的增強(qiáng)而增大。
　　 2.各處理組細(xì)胞采用熒光探針和流式檢測細(xì)胞的凋亡情況：
　　 (1)采用Hoechst33342染色細(xì)胞核觀察到單獨(dú)姜黃素處理后兩種鼻咽癌細(xì)胞的密度有所下降，核部分凝集，發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光；但是經(jīng)0.2J/cm2的紫色LED光照射姜黃素后可看到大量的鼻咽癌細(xì)胞核碎裂、濃染和凝集。
　　 (2)PI染色進(jìn)行流式分析發(fā)現(xiàn)單獨(dú)姜黃素和紫色LED光照射

9、姜黃素處理組細(xì)胞的凋亡率不同，CNE1由6.65％升為36.55％；同時(shí)CNE2也由2.55％上升到25.53％。
　　 3.在CNE1細(xì)胞中姜黃素處理后細(xì)胞發(fā)生了G2/M和S期阻滯，由對照的6.25％和13.35％變?yōu)?5.5％和28.9％，紫色LED光照射姜黃素后細(xì)胞G2/M細(xì)胞比例為10.1％，而S期細(xì)胞比例由28.9％達(dá)到了51.85％；CNE2細(xì)胞中單獨(dú)姜黃素處理后細(xì)胞都發(fā)生了S期阻滯，由對照的28.9％變?yōu)?6.65

10、％，紫色LED光照射姜黃素后則升到56.55％，同時(shí)G2/M期的細(xì)胞比例也達(dá)到了22.85％，和CNE1相比G2/M期阻滯明顯。
　　 4.NPC胞內(nèi)活性氧的水平從30min直到120min呈現(xiàn)上漲的趨勢，CNE1細(xì)胞內(nèi)的ROS從10.5逐漸增長到46.2；CNE2細(xì)胞內(nèi)的ROS也由10.1升為56.5。
　　 5.紫色LED光照射姜黃素后CNE1細(xì)胞活性氧水平顯著升高，0.1、0.2和0.4J/cm2紫色LED光照射后

11、的活性氧分別為49.8、80.7和392.8；同樣類似的結(jié)果也發(fā)生在CNE2，對應(yīng)的光能量密度照射產(chǎn)生的活性氧為136.1、161.2和308.1。
　　 6.在紫色LED光照射姜黃素處理前加入活性氧抑制劑后紫色LED光照射后CNE1的細(xì)胞抑制率由26.8％分別降低為23.36％、24.34％和20.25％；同樣CNE2的抑制率也從22.36％減少到18.69％、21.4％和15.6％。
　　 結(jié)論：
　　 1.