siRNAs干擾EBNA1對(duì)EBV的陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞活力影響及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一種常見的人類γ-皰疹病毒,與一系列的人類惡性腫瘤相關(guān),包括鼻咽癌。EB病毒在其感染的腫瘤細(xì)胞中呈潛伏性感染,在細(xì)胞核外以環(huán)狀游離體(episome)的形式存在,并表達(dá)病毒潛伏基因。EB病毒編碼的核抗原1(EBNA1)是唯一在所有感染細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的病毒蛋白。EBNA1在EB病毒的潛伏感染中起著重要作用,包括EB病毒基因組的復(fù)制和有絲分裂分離以及對(duì)其他病毒潛伏基因的轉(zhuǎn)錄激活

2、。C666-1細(xì)胞系來(lái)源于未分化的鼻咽癌(NPC),是唯一持續(xù)攜帶EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞系,表達(dá)了EB病毒編碼的小RNA(EBERs)、EBNA1蛋白和潛伏膜相關(guān)蛋白(LMP)轉(zhuǎn)錄本。該細(xì)胞系攜帶了EBV-1基因組,具有羧基末端30bp堿基缺失的LMP1基因和V-val亞型的EBNA1基因。C666-1細(xì)胞系與中國(guó)華南地區(qū)常見的鼻咽癌異常相似,是鼻咽癌與EB病毒關(guān)系研究中重要而有力的工具。本課題目的在于利用RNA干擾技術(shù)抑制C666-1細(xì)

3、胞中EBNA1的表達(dá),研究EBNA1在鼻咽癌發(fā)病過(guò)程中的作用。
　　 方法：設(shè)計(jì)了4條針對(duì)V-val型EBNA1編碼區(qū)的siRNAs并轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞；采用Western blot證實(shí)了能有效抑制EBNA1表達(dá)的干擾序列；甲基噻唑基四唑(MTT)活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EBNA1干擾后C666-1細(xì)胞活力的變化,并利用2,7二氯熒光素二脂(DCFDA)探討了細(xì)胞活力變化與活性氧(ROS)之間的關(guān)系；同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR芯片技術(shù)探索了和

4、氧化應(yīng)激與抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄普變化,并通過(guò)RT-PCR和western blot進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：Western blot證實(shí)了2條干擾序列EBNA1-1414和EBNA1-1437能有效抑制EBNA1表達(dá)；干擾EBNA1后C666-1細(xì)胞活力較對(duì)照組降低,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生增加；PCR芯片實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾EBNA1后花生四烯酸鹽12-脂氧合酶(ALOXl2)基因蛋白表達(dá)有下調(diào),谷胱甘肽還原酶(GSR)和過(guò)氧化物酶3(P