EBV-LMP1介導(dǎo)SPLUNC1調(diào)節(jié)miR-141-PTEN通路影響鼻咽癌細(xì)胞增殖與凋亡的分子機制.pdf

1、[研究背景]
　　 研究發(fā)現(xiàn)DNA腫瘤病毒中有些病毒的編碼產(chǎn)物能與宿主細(xì)胞內(nèi)抑制細(xì)胞生長和促進細(xì)胞分化的蛋白結(jié)合，使其失活而發(fā)揮致瘤作用。EBV(Epstein-Barr virus，EBV)可能也具有此作用。我室克隆得到的鼻咽組織相關(guān)的特異性表達基因(nashopharynix associated specific，NASG)，即短腭、肺及鼻咽上皮克隆(Short Palate，Lung and Nasalepitheliu

2、m Clone1，SPLUNC1)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)組織及細(xì)胞系中表達下調(diào)，是一個潛在的鼻咽癌抑瘤基因，初步研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能促使感染EBV的細(xì)胞裂解，啟動補體途徑和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)作用對EBV進行清除，并能通過抑制EBV關(guān)鍵基因潛伏膜蛋白1(Latent membrane

3、 protein1，LMP1)的表達降低EBV的致瘤能力。miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)miR-141能受到SPLUNC1的調(diào)控。生物信息學(xué)分析顯示第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)為miR-141的靶基因。那么SPLUNC1能否通過miR-141調(diào)控PTEN及其下游信號通路呢？EBV對SPLUNC1的表達

4、會有影響嗎？
　　 本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，對EBV與SPLUNC1之間的相互影響進行探討，并明確SPLUNC1是否通過miR-141調(diào)控了PTEN及其下游絲蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase，Akt)信號通路，探索EBV整合入細(xì)胞后是否影響SPLUNC1及受其調(diào)控的miR-141-PTEN-Akt信號通路，以期為EBV的致瘤機制和SPLUNC1發(fā)揮抑瘤作用的信號通路增添新的一筆。
　　 [S

5、PLUNC1抑制整合入細(xì)胞內(nèi)的EBV關(guān)鍵基因表達的同時SPLUNC1自身表達受損]
　　 由于EBV不能直接感染上皮細(xì)胞，因此我們采用共培養(yǎng)的方式使細(xì)胞感染EBV。將構(gòu)建的過表達SPLUNC1的HNE2細(xì)胞和空白對照HNE2/GFP與B95-8細(xì)胞（能產(chǎn)EBV）共培養(yǎng)24小時，隨后采用補體激活的細(xì)胞毒實驗去除B95-8細(xì)胞并通過擴增猿猴特異性基因CAJA-DRBI明確B95-8細(xì)胞是否清除干凈;結(jié)果顯示:整合入過表達SPLUNC

6、1的細(xì)胞內(nèi)的EBV關(guān)鍵基因EBER、BZLF、LMP1表達明顯低于空載體組;HNE2/SPLUNC1細(xì)胞在第1天細(xì)胞接觸EBV時，細(xì)胞會應(yīng)激性地增加SPLUNC1的表達以抵抗病毒的侵入，但是在病毒整合入細(xì)胞后第2天、3天、5天、7天、9天，細(xì)胞內(nèi)SPLUNC1的表達會逐漸降低，并不能恢復(fù)到細(xì)胞感染病毒前水平。以上結(jié)果證實SPLUNC1能抑制整合入細(xì)胞內(nèi)的EBV關(guān)鍵基因的表達，與此同時EBV整合入細(xì)胞后也能抑制SPLUNC1的表達。

7、>　　 [SPLUNC1通過miR-141調(diào)控PTEN-Akt信號通路影響NPC細(xì)胞的增殖和凋亡]
　　 miRNA芯片顯示miR-141受到了SPLUNC1的調(diào)控。我們通過實驗證實鼻咽癌細(xì)胞過表達SPLUNC1能降低miR-141的表達，siRNA瞬時干擾SPLUNC1的表達后，miR-141表達明顯增高;且miR-141的表達與細(xì)胞分化程度和惡性程度相關(guān)。通過顯微切割獲得純化后的NPC組織和正常鼻咽上皮(normal na

8、sopharyngeal epithelium，NPE)組織，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SPLUNC1在NPC組織中的表達明顯比NPE組織要低，而miR-141在NPC組織中的表達明顯比NPE組織要高，兩者的表達呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　 生物信息學(xué)分析顯示PTEN為miR-141的靶基因。于是我們將 miR-141的mimics及inhibitors轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞和NPC細(xì)胞系，檢測PTEN的表達情況。結(jié)果顯示miR-141的mimic

9、s能顯著減少PTEN的表達，而在轉(zhuǎn)染miR-141的inhibitor后細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達明顯增加;檢測NPE和NPC組織中PTEN的表達時，也顯示PTEN在NPC組織中的表達明顯低于NPE，NPC組織中PTEN和miR-141的表達呈負(fù)相關(guān)。
　　 既然miR-141受到SPLUNC1的調(diào)控，PTEN是miR-141的靶基因，那么SPLUNC1能否調(diào)控PTEN的表達。通過過表達SPLUNC1和加入全反式維甲酸來增加NPC細(xì)胞

10、SPLUNC1的表達，證實SPLUNC1表達增加后，PTEN的表達也增加了;同時免疫熒光檢測顯示SPLUNC1并不影響PTEN在細(xì)胞內(nèi)的分布。干擾SPLUNC1的表達又可明顯下調(diào)PTEN的表達。隨后在過表達SPLUNC1的NPC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-141的mimics，檢測發(fā)現(xiàn)miR-141的mimics可部分抑制SPLUNC1上調(diào)PTEN的表達。其結(jié)果說明SPLUNC1除了通過miR-141影響PTEN外，還可能通過其它通路來影響PT

11、EN的表達。
　　 PTEN參與細(xì)胞增殖和凋亡的信號通路主要是通過Akt信號通路來發(fā)揮作用。因此我們檢測了NPC細(xì)胞過表達SPLUNC1后對Akt信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)過表達SPLUNC1能明顯抑制p-Akt的表達，干擾SPLUNC1后p-Akt的表達則明顯增加，說明SPLUNC1能通過PTEN影響Akt的磷酸化和活化。通過采用PTEN的抑制劑BPV處理過表達SPLUNC1的細(xì)胞系，證實SPLUNC1還能夠部分拮抗PTEN的抑制劑

12、BPV對細(xì)胞Akt信號通路的影響。
　　 隨后我們又通過流式細(xì)胞術(shù)證實過表達SPLUNC1能將細(xì)胞周期阻滯在G1期;SPLUNC1能上調(diào)p27蛋白的表達，下調(diào)cyclin D和cyclin E、CDK2蛋白的表達;同時還發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能拮抗BPV的促增殖和抗凋亡作用。裸鼠成瘤實驗進一步證實過表達SPLUNC1能通過調(diào)控PTEN-Akt通路抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進而抑制裸鼠移植瘤的形成。
　　 [EBV/LMP1

13、與SPLUNC1相互影響共同調(diào)控miR-141-PTEN-Akt信號通路]
　　 LMP1被廣泛認(rèn)為是EBV基因組中的重要致瘤基因。通過應(yīng)用過表達LMP1的正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69-LMP1，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)LMP1高表達時SPLUNC1的表達極低，miR-141的表達則較高，引起PTEN表達降低而激活A(yù)kt信號通路。但NP69-LMP1細(xì)胞過表達SPLUNC1后，LMP1的表達明顯被抑制，并上調(diào)PTEN的表達而抑制Akt通路的激活

14、。結(jié)果說明LMP1能通過抑制SPLUNC1進而影響miR-141-PTEN-Akt-路，但恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)SPLUNC1的表達又能抑制LMP1的表達，并增加PTEN的表達，從而導(dǎo)致下游Akt通路的失活。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能與EBV存在相互影響;SPLUNC1可通過下調(diào)miR-141上調(diào)PTEN的表達，進而負(fù)性調(diào)控Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制NPC細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)NPC細(xì)胞凋亡;EBV/LMP1可通過抑制SPLUNC1的