貝伐單抗對耐藥鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景與目的： 鼻咽癌是中國南方和東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入晚期，有資料顯示，Ⅲ～Ⅳ期患者占總數(shù)的85%左右。放療聯(lián)合化療是治療鼻咽癌的主要方法，但整體治療效果仍然不盡人意，多數(shù)晚期患者仍因化學(xué)藥物治療失敗而死亡，這很大程度歸因于癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）。腫瘤多藥耐藥是指一種藥物作用于腫瘤使之產(chǎn)生耐藥性后，該腫瘤未接觸過的、結(jié)構(gòu)無關(guān)、機(jī)制各異的多種抗腫瘤

2、藥物也具有交叉耐藥性。腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前已知的包括：（1）藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)或攝取障礙；（2）藥物的活化障礙；（3）靶酶質(zhì)和量的改變；（4）增加利用內(nèi)替的代謝途徑；（5）分解酶的增加；（6）修復(fù)機(jī)制增加；（7）由于特殊的膜糖蛋白的增加，使藥物更多被排出胞外；（8）DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)減少。目前研究最多的是MDR-1基因以及由此基因編碼的P-gp糖蛋白。但是根據(jù)以上機(jī)制研究的相應(yīng)藥物并不能有效解決腫瘤細(xì)胞耐藥問題。最新觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤耐

3、藥性產(chǎn)生的本質(zhì)是各種因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機(jī)制的下調(diào)，細(xì)胞抗凋亡而逃避殺傷，研究者都試圖尋找促進(jìn)耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡的方法。 研究方法： 1．人鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE2及其耐藥細(xì)胞亞系CNE2/DDP培養(yǎng)于含10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃5%CO2飽和濕度孵箱。含0．25%胰蛋白酶和0．02%EDTA的完全消化液消化傳代。流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期及細(xì)胞內(nèi)熒光藥物羅丹明的蓄積，測繪細(xì)胞生長曲線、計(jì)算倍增時(shí)間并在光

4、鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測CNE2和CNE2/DDP對順鉑、吉西他濱、5-氟尿嘧啶、長春新堿等4種常用抗腫瘤藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥系數(shù)（resistance index，RI）。 2．取對數(shù)生長期CNE2/DDP細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為1×105/ml，每孔100μl（104個(gè)）。分1個(gè)空白對照組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入：貝伐單抗10μg/ml、順鉑0．1μg/ml

5、、貝伐單抗10μg/ml+順鉑0．1μg/ml、順鉑0．2μg/ml、貝伐單抗10μg/ml+順鉑0．2μg/ml，培養(yǎng)72h，MTT法測定各組細(xì)胞存活率，進(jìn)而計(jì)算藥物殺傷率。對照組6個(gè)孔吸光度（OD）值取平均值，各實(shí)驗(yàn)組每孔吸光度值與該平均值的比值即為每孔的細(xì)胞存活率，1-存活率就是每孔藥物的殺傷率。用公式表示：殺傷率=（1-實(shí)驗(yàn)組各孔OD值/對照組平均OD值）×100%。采用SPSS10．0軟件中One-Way Anova方法分析各

6、實(shí)驗(yàn)組藥物殺傷率的差別。 3．CNE2/DDP細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于50ml培養(yǎng)瓶，鏡下觀察細(xì)胞呈貼壁生長后，分別加入順鉑0．1μg/ml、順鉑0．1μg/ml+貝伐單抗10μg/ml，1瓶CNE2/DDP作為空白對照，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，AnnexinⅤ和碘化丙錠（PI）雙染，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測各瓶細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS10．0軟件中Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)分析不同處理方法間細(xì)胞凋亡的差異，

7、P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．在CNE2/DDP細(xì)胞培養(yǎng)液中添加貝伐單抗，終濃度為10μg/ml，每4天傳代1次，連續(xù)傳4代，得到細(xì)胞CNE2/DDP/Bev。用半定量RT-PCR方法檢測MDR-1、Bcl-2、Bax等基因在CNE2、CNE2/DDP、CNE2/DDP/Bev細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，計(jì)算相對表達(dá)量。 5．建立鼻咽癌耐藥細(xì)胞CNE2/DDP裸鼠皮下移植瘤模型，將25只荷CNE2/DDP移植瘤裸鼠隨機(jī)分成5組

8、進(jìn)行藥物治療（瘤直徑至少為5mm）：①空白對照組（A組）：無菌生理鹽水；②單藥貝伐單抗組（B組）：5mg/kg；③單藥順鉑組（C組）：4mg/kg：④聯(lián)合1組（D組）：貝伐單抗5mg/kg+順鉑4mg/kg；⑤聯(lián)合2組（E組）：貝伐單抗5mg/kg+順鉑2mg/kg，均為腹腔注射（0．5ml/只/次），2次/周，連續(xù)用藥4周。其中，經(jīng)順鉑治療組（C、D、E組）于用藥前30分鐘皮下注射賽格恩（3mg/kg）預(yù)防胃腸道反應(yīng)。停藥1周后處死各

9、組裸鼠并稱重，收集皮下移植瘤標(biāo)本測量瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率；免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測各組移植瘤組織的微血管密度（microvesseldensity，MVD），比較各組微血管密度的差異；RT-PCR進(jìn)一步分析各組經(jīng)藥物治療后MDR-1、Bcl-2、Bax等基因的表達(dá)情況。各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10．0軟件中One-way ANOVA方差分析，兩兩比較采用LSD法（Least-significa

10、nt-Difference）分析，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1．經(jīng)生長曲線計(jì)算出CNE2和CNE2/DDP的倍增時(shí)間分別為17．13h和23．13h。DDP對CNE2和CNE2/DDP的IC50分別是0．03μg/ml和0．45μg/ml，RI為14．94，吉西他濱（gemcitabine，gem）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）及長春新堿（vincristine，VCR）的R

11、I分別為17．62、6．60及14．17，表明其具有多藥耐藥的特征，并且耐藥性能穩(wěn)定。流式細(xì)胞測定顯示CNE2/DDP的G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少；CNE2/DDP內(nèi)羅丹明的蓄積低于CNE2（3．56vs．220．35）。CNE2/DDP形態(tài)在光鏡下變圓，大小不一，胞漿有較多顆粒。 2．細(xì)胞殺傷結(jié)果顯示：單用10μg/ml貝伐單抗時(shí)，細(xì)胞殺傷率與空白對照組相似（5．2%±4．3%vs．0．0%±4．1%，P=0．180）

12、。10μg/ml貝伐單抗分別與0．1μg/ml及0．2μg/ml順鉑聯(lián)合的殺傷率均高于單用順鉑（42．3%±6．5%vs．34．4%±5．4%，P=0．041；62．6%±5．5% vs．50．0%±5．9%，P=0．009）。 3．順鉑聯(lián)合貝伐單抗誘導(dǎo)的CNE2/DDP細(xì)胞凋亡：與對照細(xì)胞相比，經(jīng)0．1μg/ml順鉑或聯(lián)合10μg/ml貝伐單抗處理24h后的CNE2/DDP細(xì)胞，出現(xiàn)明顯PS外化現(xiàn)象，即FITC高染區(qū)而PI低染

13、區(qū)的早期凋亡細(xì)胞增多（8．87%±1．06% vs．3．25%±0．75%，38．20%±3．51% vs．3．25%±0．75%），F(xiàn)ITC和PI均高染區(qū)的晚期凋亡及繼發(fā)性壞死細(xì)胞增多（41．71%±9．78% vs．5．70%±0．43%，48．96%±6．90% vs．5．70%±0．43%），而FITC和PI均低染區(qū)的活細(xì)胞減少。對照組及2個(gè)實(shí)驗(yàn)組間總凋亡率差異有顯著性意義（P=0．027），0．1μg/ml順鉑+10μg/ml

14、貝伐單抗組的總凋亡率（87．29%±3．38%）高于單用順鉑組（50．58%±8．83%）。 4．半定量RT-PCR方法檢測顯示CNE2、CNE2/DDP和CNE2/DDP/Bev中MDR-1相對表達(dá)量分別為0．623、1．364和1．165，Bcl-2分別為0．613、0．952和0．135，Bax分別為0．665、0．387和1．751。 5．治療結(jié)束后順鉑常規(guī)劑量組（C、D組）裸鼠體重較其它各組均減輕（P<0．00

15、1），而其余各組之間體重?zé)o顯著差異（P>0．05）。與空白對照組相比，經(jīng)聯(lián)合用藥組（D、E組）的移植瘤生長顯著受到抑制，其抑瘤率分別為59．37%±3．29%、63．17%±3．05%，差異均有顯著性意義（P<0．001），單藥貝伐單抗和單藥順鉑組抑瘤率僅為6．03%±4．68%、5．71%±8．30%，與對照組之間無顯著差異（P=0．067，P=0．081），兩個(gè)聯(lián)合用藥組之間的抑瘤率也無差異（P=0．235）；經(jīng)貝伐單抗治療組（B、

16、D、E組）的微血管密度表達(dá)下降（分別為13．60±1．11、12．80±0．90、13．22±1．02），P值均<0．001； RT-PCR結(jié)果亦顯示，與空白對照組相比，貝伐單抗組和聯(lián)合用藥組（B、D、E組）Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0．001）、Bax mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0．001），但該三組之間無差異，實(shí)驗(yàn)各組之間在耐藥基因MDR-1 mRNA表達(dá)上均未見顯著差異（P=0．918）。 結(jié)論： 1．貝伐單抗

17、可以顯著增加人鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系CNE2/DDP對順鉑的敏感性。貝伐單抗與順鉑聯(lián)合時(shí)細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)，單用貝伐單抗殺傷作用不明顯，聯(lián)合用藥時(shí)增加貝伐單抗?jié)舛炔⒉荒芴岣邭省?2．貝伐單抗可以促進(jìn)鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞CNE2/DDP凋亡。貝伐單抗聯(lián)合順鉑所致凋亡率明顯高于單用順鉑。 3．貝伐單抗對耐藥相關(guān)基因的影響不大，但可以顯著影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡。對于親本的CNE2細(xì)胞，當(dāng)用順鉑誘導(dǎo)其耐藥，再用貝

18、伐單抗處理耐藥細(xì)胞，其MDR-1的表達(dá)先顯著上調(diào)，再輕微下調(diào)；Bcl-2基因（凋亡抑制基因）的表達(dá)先上調(diào)再顯著下調(diào)；Bax基因（凋亡促進(jìn)基因）的表達(dá)先下調(diào)再顯著上調(diào)。 4．貝伐單抗對荷CNE2/DDP裸鼠移植瘤有顯著抑制作用，同時(shí)提高CNE2/DDP耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性，兩者聯(lián)合用藥有顯著的協(xié)同效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抑制其微血管形成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。 總而言之，VEGF單克隆抗體貝伐單抗可以通過誘導(dǎo)耐藥鼻咽癌細(xì)胞凋亡