EB病毒VCA和EBNA1重組抗原的表達(dá)及其在鼻咽癌診斷中的應(yīng)用.pdf

1、EBV是一種重要的DNA病毒，是傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)的病原，與非洲Burkitt s淋巴肉瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)等惡性腫瘤有密切的關(guān)系，被列為可能致癌的人類腫瘤病毒之一。大量研究結(jié)果已證實，EBV是NPC重要的誘發(fā)因子，臨床上將其分為五期，NPC早期(Ⅰ、Ⅱ期)十年存活率可達(dá)到77﹪，NPC晚期(Ⅲ、Ⅳ，Ⅴ期)5年存活率<40﹪。NPC的早期診斷和治療是提高患者生存率、改善生存質(zhì)量的重要手段之一。 目前國內(nèi)外EBv

2、的血清學(xué)檢測采用免疫熒光法、免疫酶法和酶聯(lián)免疫吸附分析法等進(jìn)行檢測。免疫熒光法因操作繁瑣、特異性差且需特殊儀器，已被逐漸淘汰；免疫酶法涂片細(xì)胞表達(dá)抗原載量不穩(wěn)定、陽性細(xì)胞計數(shù)受主觀因素影響等缺點，使得試劑的批間差大，不同檢驗人員得出的結(jié)果也存在較大差異。 為克服以往NPC試劑檢測抗原的缺點，在靈敏度和特異性兩個指標(biāo)上達(dá)到理想的檢測效果，我們選擇VCA蛋白復(fù)合物中的gp125和p18的編碼基因(BALF4和BFRF3)以及EBNA

3、1基因作為目的基因，采用大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分別構(gòu)建表達(dá)VCA-BALF4、EBNA1(aa390-641)和VCA-BFRF3的工程菌株，以期獲得具有免疫反應(yīng)性的重組抗原，同時使用表達(dá)的重組抗原作為包被抗原制備ELISA試劑檢測NPC病人VCA/IgA和EBNA1/IgA抗體，并比較單獨和聯(lián)合使用重組抗原檢測NPC病人VCA/IgA和INA1/IgA抗體的靈敏度和特異性，如靈敏度和特異性仍無法滿足要求，我們將在此基礎(chǔ)上，嘗試根據(jù)

4、抗原表位預(yù)測和多肽合成的方法對EBV抗原表位進(jìn)行篩選并選用含有主要抗原決定簇的抗原片段研制EBV抗體檢測試劑以期能改善檢測抗原質(zhì)量，提高NPC血清學(xué)檢測的靈敏度和特異性，并探討重組抗原在NPC免疫檢測中的應(yīng)用。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 第一部分 EB病毒VCA和EBNAl基因片段在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及初步應(yīng)用 以EBV DNA為模版，通過PCR獲得目的基因片段BALF4(S)(1008bp)，BFRF3(5

5、31bp)和EBNA1(759bp)，與原核表達(dá)載體PGEX-5X-1連接，成功構(gòu)建PGEX-5X-BALF4(S)、PGEX-5X-BFRF3和PGEX-5X-EBNA1的工程菌株，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)GST/BALF4(S)、GST/BFRF3和GST/EBNAl重組融合蛋白，重組蛋白的分子量分別為63kDa、44kDa、54kDa。產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、免疫印跡、ELISA鑒定后，采用親和層析純化目的蛋白，并將其作

6、為包被抗原，制備ELISA試劑，對300份NPC病人和500份正常人標(biāo)本EBV-IgA抗體進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)用GST/BFRF3作為包被抗原，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為59.0﹪和85﹪：用GST/BALF4(S)作為包被抗原，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為62-3﹪和90﹪；用GST/EBNA1作為包被抗原，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為70.7﹪和91﹪。將三種抗原分別配對混合包被酶標(biāo)

7、板，檢測NPC病人和正常對照組的IgA-EBV抗體，GST/EBNA1+GST/BALF4(S)是最佳配對，能識別82﹪(246/300)的NPC病人，特異性可達(dá)到84﹪(80/500)。該結(jié)果在靈敏度和特異性方面均不能令人滿意，假陽性和漏檢率均過高，且本研究中的原核表達(dá)蛋白以包涵體形式存在，純化困難，成本昂貴，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。 第二部分 EB病毒VCA和EBNA1基因酵母工程菌的構(gòu)建、表達(dá)及在NPC中的診斷價值評估

8、我們將VCA-BALF4(L)(2574bp)基因與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9連接，將VCA-BALF4(S)、VCA-BFRF3和EBNA1基因分別與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZaA連接，在畢赤酵母菌GS115中成功地高效表達(dá)了分泌型高特異的VCA-BALF4(L)、VCA-BALF4(S)、VCA-BFRF3和EBNA1重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物的分子量分別為125kDa、37kDa、18kDa和28 kDa，Western-blot證實這四

9、條帶均有免疫原性，經(jīng)硫酸銨沉淀，離子交換層析及分子篩等多步純化后，得到了純度達(dá)90﹪以上的重組蛋白。ELISA檢測的效價顯示了表達(dá)產(chǎn)物與NPC病人血清間具有良好的免疫反應(yīng)性；VCA-BALF4(L)、VCA-BALF4(S)、VCA-BFRF3和EBNA1四種目的蛋白的表達(dá)水平分別為62﹪、5 1﹪、59﹪~I 50﹪，表達(dá)量分別為20mg/L、65mg/L、77mg/L和67mg/L，可以滿足大規(guī)模生物制品生產(chǎn)的需要。 重組蛋

10、白經(jīng)純化后對300份NPC病人和500份正常人標(biāo)本EBV-IgA抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)用VCA-BFRF3作為包被抗原，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為68.7﹪和92﹪；用VCA-BALF4(S)作為包被抗原，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為76.3﹪和96﹪；用VCA-BALF4(L)作為包被抗原，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為77.0﹪和92﹪；用EBNA1作為包被抗原，在NPC病人和正常對

11、照中，靈敏度和特異性分別為81.4﹪和95.8﹪。其中VCA-BALF4(S)的靈敏度(76.3﹪)和VCA-BALF4(L)的靈敏度(77﹪)比較接近，但特異性前者(96﹪)明顯好于后者(92﹪)。同時發(fā)現(xiàn)，針對VCA-BALF4(S)的IgA抗體水平與NPC的臨床分期有一定關(guān)系(P<0.05)，而陽性率則與臨床分期無關(guān)。EBNA1的IgA抗體的靈敏度在NPC Ⅰ期和Ⅱ期病人中最高(72.3﹪和81.2﹪)，提示在NPC的早期診斷中，

12、EBNA1可能是比BALF4和BFRF3更為靈敏的一個標(biāo)志物。 第三部分 EB病毒BALF4基因抗原表位分析及短肽合成 我們采用了蛋白質(zhì)抗原表位預(yù)測及合成肽技術(shù)，在體外合成了5條抗原肽，包被聚丙乙烯板，對100份NPC病人和100份正常人標(biāo)本EBV-IgA抗體進(jìn)行檢測，在NPC病人和正常對照中，陽性率分別為47.0﹪和54.0﹪(peptide-1)；54.0﹪和22.0﹪(peptide-2)；53.0﹪和25.0﹪(

13、peptide-3)；45.0﹪和17.0﹪(peptide-4)；57.0﹪和22.0﹪(peptide.5)。對結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，1號肽在正常人群中的陽性檢出率54.0﹪大于在NPC病人中的陽性檢出率(47.0﹪)，特異性不好，舍去不用。綜合分析2，3，4，5號多肽的檢測結(jié)果，推測2，3，4，5號多肽所在的區(qū)域可能為BALF4主要抗原決定簇所在區(qū)域。我們下一步將在酵母中表達(dá)包含有2，3，4，5號多肽抗原的BALF4基因，以期能得到具

14、有更高性能的檢測抗原。 第四部分EB病毒BALF4重組抗原基因片段在畢赤酵母中的表達(dá)及在NPC檢測中的應(yīng)用 根據(jù)抗原預(yù)測及合成肽對NPC病人的檢測結(jié)果，我們重新設(shè)計引物，擴(kuò)增765bp的VCA-BALF4(S1)(aa548-802)基因與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZaA連接并轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，成功地高效表達(dá)了分泌型高特異的VCA-BALF4(S1)重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為28000，Western-blot證實有免疫原

15、性，經(jīng)鹽析后，得到了純度達(dá)90﹪以上的重組蛋白。ELISA檢測的效價顯示了表達(dá)產(chǎn)物與NPC病人血清間具有良好的免疫反應(yīng)性；VCA-BALF4(S1)目的蛋白的表達(dá)水平為50﹪，表達(dá)量為30mg/L，可以滿足大規(guī)模生物制品生產(chǎn)的需要。 我們將表達(dá)的BALF4(S1)蛋白作為包被抗原分別對300份NPC標(biāo)本和500份正常人標(biāo)本進(jìn)行檢測，在NPC病人和正常對照中，靈敏度和特異性分別為76.3﹪和97.6﹪。靈敏度與BALF4(S)和B

16、ALF4(L)相近，但特異性有所提高。 結(jié)論及研究意義: (1)首次利用畢赤酵母系統(tǒng)高效分泌表達(dá)了VCA-BALF4(L)(2574bp)、VCA-BALF4(S)(aa287-623)、EBNA1(390-641)和VCA-BFRF3重組蛋白，作為包被抗原制備ELISA試劑用于檢測NPC病人和正常對照組血清中IgA/VCA和IgA/EBNA1抗體，對四種重組抗原在NPC血清篩選中的診斷價值進(jìn)行了評估。 (2)通

17、過蛋白質(zhì)抗原表位預(yù)測及合成肽技術(shù)對gp125的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，合成短肽作為包被抗原對NPC病人和正常人群進(jìn)行檢測，得到具有診斷價值的四條短肽，gp125的主要抗原決定簇可能位于該區(qū)域內(nèi)。 (3)首次利用畢赤酵母系統(tǒng)高效分泌表達(dá)了VCA-BALF4(S1)(aa548-802)重組蛋白，發(fā)現(xiàn)使用EBNA1和VCA-BALF4(S1)作為包被抗原聯(lián)合檢測NPC病人，可提高NPC病人的陽性檢出率。 (4)獲得了有應(yīng)用價