EB病毒早期彌散型抗原的畢赤酵母表達(dá)及其在鼻咽癌篩查中的應(yīng)用.pdf

1、[研究背景] 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于中國(guó)南方，尤以廣東省最多見(jiàn)。15年來(lái)發(fā)病率和死亡率一直居高不下(發(fā)病率：9.83-11.88/10萬(wàn)，死亡率：10-13/10萬(wàn))。目前鼻咽癌病因尚不明確，無(wú)確實(shí)可行的一級(jí)預(yù)防措施，故對(duì)鼻咽癌的防治目前主要寄希望于二級(jí)預(yù)防。篩查作為惡性腫瘤二級(jí)預(yù)防的主要手段在鼻咽癌的防治中作用重大，通過(guò)篩查，我們可以早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早

2、期治療鼻咽癌，使鼻咽癌患者的5年生存率得到顯著提高。因此尋找一種高效，方便快捷，經(jīng)濟(jì)的鼻咽癌篩查手段是十分重要且迫切的。 自1967年Helen在鼻咽癌病人的血清中發(fā)現(xiàn)EB病毒(Epstein—barr virus，EBV)特異性IgA抗體，1969年由鼻咽癌活檢組織培養(yǎng)出的類(lèi)淋巴母細(xì)胞中分離到EB病毒以來(lái)，大量研究結(jié)果表明EB病毒是鼻咽癌重要的誘發(fā)因子，并且在鼻咽癌患者體內(nèi)經(jīng)常存在升高的抗EB病毒不同抗原的特異性抗體。長(zhǎng)期以來(lái)

3、EB病毒感染的血清學(xué)檢測(cè)就被用作鼻咽癌早期診斷的重要手段被廣泛應(yīng)用，其中對(duì)診斷鼻咽癌最具意義的EB病毒蛋白主要有：EB病毒殼抗原(VCA)，早期抗原(EA)，核心抗原(NA1)和潛伏膜蛋白2A(LMP2A)等。 EB病毒早期抗原(early antigen，EA)對(duì)鼻咽癌的診斷最具特異性，被認(rèn)為是鼻咽癌特異性的標(biāo)志，抗IgA/EA抗體的檢測(cè)長(zhǎng)期以來(lái)就被作為診斷鼻咽癌的輔助指標(biāo)。EA是EB病毒早期抗原(early antigen

4、)的縮寫(xiě)，由EB病毒早期彌散型抗原(EA—D)和局限型抗原(EA—R)兩種物質(zhì)組成的復(fù)合物，但在鼻咽癌患者血清中EA抗原IgA類(lèi)抗體主要是與D型EA產(chǎn)生特異性反應(yīng)，因此有的學(xué)者認(rèn)為建立D型EA為主的EA抗原IgA類(lèi)抗體的血清學(xué)檢測(cè)手段對(duì)提高鼻咽癌早期診斷的準(zhǔn)確率十分的重要。早期抗IgA/EA抗體檢測(cè)的方法主要有免疫熒光法(fluoroimm unoassay，F(xiàn)IA)，免疫酶法(immunoenzymatic assay，IE)等，但是

5、由于操作繁瑣，特異性差且需要特殊儀器，結(jié)果讀取存在主觀差異等缺點(diǎn)給鼻咽癌的篩查帶來(lái)一定的困難。ELISA作為一種新型的檢測(cè)方法克服了以上缺點(diǎn)顯示出極大的優(yōu)越性受到人們的關(guān)注，逐漸被許多學(xué)者應(yīng)用和探討。 [研究目的] 針對(duì)目前抗IgA/EA抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒中尚無(wú)EA抗原以真核表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原者，作為對(duì)現(xiàn)有試劑盒的改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建EA—D(P54)的真核表達(dá)載體并在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。以純化的重組蛋白建立初

6、步間接ELISA方法，開(kāi)發(fā)鼻咽癌早期診斷試劑盒，用于鼻咽癌的大規(guī)模篩查。 [研究方法] 培養(yǎng)細(xì)胞B95-8，提取EB病毒基因組DNA作為擴(kuò)增模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增BMRF1基因片段編碼區(qū)域序列；構(gòu)建重組質(zhì)粒PpICZα A—BMRF1；電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，篩選His+ Mut+表型轉(zhuǎn)化子并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)；飽和硫酸銨分級(jí)鹽析純化目的蛋白；純化目的蛋白做Western—blot檢測(cè)免疫活性；并包被酶標(biāo)板，建立抗IgA/

7、EA—D抗體的ELISA檢測(cè)方法；收集300例鼻咽癌患者和200例健康對(duì)照人群血清，進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)檢測(cè)結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。主要步驟入下： 1.B95-8細(xì)胞的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取 B95-8細(xì)胞用含有10％FCS，100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，每周換液兩次。收取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，采用傳統(tǒng)的酚—氯仿—異丙醇方法提取其基因組DNA，用滅菌水溶解，于—

8、20℃保存?zhèn)溆谩?2.PCR擴(kuò)增目的片段 按照GenBank發(fā)表的B95-8細(xì)胞中EB病毒株BMRF1基因片段編碼區(qū)的參考序列，以及載體pPICZα A的多克隆酶切位點(diǎn)，參考引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物： P1：5'CGGAATTCATGGAAACCACTCAGAC3'含Eco RⅠ酶切位點(diǎn)； P2：5'GCGGATCCGATGGTGTTAATTGAGG3’含KpnⅠ的酶切位

9、點(diǎn)；以EB病毒基因組DNA作為模板PCR擴(kuò)增目的片段。 3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 膠回收PCR產(chǎn)物，并與載體pPICZα A分別用Eco RⅠ和KpnⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳，回收后T4DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，將過(guò)夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在含Zeocin(終濃度25ug/ml)的低鹽LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，做雙酶切電泳鑒定及DNA測(cè)序。 4.重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞 鑒定正確的重組質(zhì)

10、粒用SacⅠ內(nèi)切酶線性化并電轉(zhuǎn)入GS115酵母細(xì)胞，于含Zeocin(終濃度100ug/ml/)的YPDS平板上篩選。所得陽(yáng)性克隆用MMH板和MDH板篩選Mut表型，篩選在MMH和MDH平板上生長(zhǎng)均良好的Mut+表型菌株作為表達(dá)菌，同時(shí)將篩選好的表達(dá)菌破壁做PCR擴(kuò)增進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化子。 5.重組蛋白的誘導(dǎo)： 將鑒定好的表達(dá)菌挑取少量，接種于BMGY中培養(yǎng)增菌，待A600達(dá)到2-6(約16-18小時(shí))，換入1/5體積的BM

11、MY液體培養(yǎng)基中，以0.5％的甲醇終濃度誘導(dǎo)表達(dá)24、48、72、84、96小時(shí)。 6.重組蛋白的純化及其濃度測(cè)定： 從誘導(dǎo)第24小時(shí)開(kāi)始，于每個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間每分別取少量上清點(diǎn)樣做SDS—PAGE分析；并用誘導(dǎo)上清包被聚丙乙烯板條行間接ELISA檢測(cè)，測(cè)定重組蛋白的抗原效價(jià)；于抗原效價(jià)最佳時(shí)回收上清，用0.22μ m的膜過(guò)濾后，經(jīng)35％PEG(6000)，4℃透析濃縮；濃縮后的誘導(dǎo)上清進(jìn)行飽和硫酸銨分級(jí)鹽析，純化目的蛋白，備

12、用；并用BCA蛋白定量測(cè)定法測(cè)定重組蛋白溶液的最終濃度。 7.Westernblot檢測(cè)重組蛋白的免疫學(xué)活性。 8.ELISA法檢測(cè)鼻咽癌病人及其健康對(duì)照的血清 1)抗原包被量的確定： 選擇方陣滴定確定最佳重組蛋白包被濃度。 2)臨界值的確定： 選擇ROC曲線法確定臨界值。 3)靈敏度，特異度的計(jì)算： 靈敏度=A/(A+B)；特異度=D/(C+D)；其中A為鼻咽癌患者陽(yáng)性例

13、數(shù)，B為鼻咽癌患者陰性例數(shù)，C為健康人陽(yáng)性例數(shù)，D為健康人陰性例數(shù)。 [研究結(jié)果] 構(gòu)建了pPICZα A—BMRF1重組質(zhì)粒；目的蛋白在畢赤酵母GS115中高效分泌表達(dá)；SDS—PAGE在58KD處顯示有相應(yīng)目的條帶；同時(shí)Western—blot也證明其有良好的免疫活性；純化目的蛋白行間接ELISA分別檢測(cè)鼻咽癌患者與正常人群血清，顯示有較佳的敏感性和特異性分別為92.7％和94.5％。 [研究結(jié)論]